活体细胞内双光子激发的光漂白特性

长波长光的强穿透能力和对活体细胞和生物组织光毒性很小的特性,使得双光子激发荧光显微术已经成为无损伤成像的重要工具.可是双光子激发的高光子密度可能会产生高次光子相互作用, 从而产生更快的光漂白.从实验上研究了离体和活体细胞内的若丹明123和若丹明B分别在单光子激发和双光子激发时的光漂白特性.在体的实验结果与离体的实验结果一致.正如期望的一样,单光子激发时光漂白速率非常近似地随着激发功率的增加而线性增加.可是,双光子激发时的光漂白速率并不是正比于激发功率的平方,而是正比于激发功率的高次方（＞3.5）.对绿色荧光蛋白（GFP）变异体CFP和YFP的实验也得到同样的结果,这就表明高次光漂白可能是双（多）光子激发中的普遍现象.因此多光子的应用可能会受到强光漂白的限制.     

深层组织双光子荧光成像激发特征的仿真分析

双光子荧光探针被广泛研究应用于生物医学成像和治疗,深入了解这类探针在生物组织中激发分布特征及其相对于单光子探针的成像优势和劣势对探针的合理选择和应用具有指导意义。然而,由于实际测量难以避开众多干扰因素的影响,因此不能准确反映其固有特征。本文选取典型生物和荧光激发参数,利用生物仿真定量分析,并通过双光子和单光子的激发成像对比,获取了双光子荧光的基本激发特征。结果发现,在相同平圆光束激发下,双光子激发由于激发效率低且需要双光子吸收,再加上较高的激发阈值,虽然激发光在组织穿透深度方面存在优势,但在组织内衰减速率快、有效穿透深度比高量子效率的单光子荧光激发浅。同时,深度方向的快速衰减会导致横向激发光能的非均匀性分布,这种非均匀性对双光子荧光影响更大。仿真分析进一步表明:在生物组织耐受的前提下提高双光子激发的功率更有利于荧光成像;增加光照半径可以减弱横向激发的不均匀性,从而改善双光子荧光成像的效果。本研究结果为双光子荧光激发、成像的应用提供了基础数据参考,本仿真方法也为快速研究光与生物组织的相互作用提供了借鉴。     

基于双光子激发的荧光相关谱测量

本文利用多光子激发激光扫描显微镜的部分光路和探测器．建立了双光子荧光相关谱系统(Two-Photo Fluorescence Correlation Spectroscopy．简称TP-FCS)。利用TP-FCS系统观察到了“光子爆发”现象．实现了染料分子的双光子激发,测量出若丹明B染料分子在蔗糖溶液中的扩散系数。实验证明该系统具有操作简便、可靠性高,费用低廉等等点,可实现单分子检测。     

可用于双色双光子显微成像的新的荧光蛋白对

双色双光子激光扫描显微技术可以用来研究生物组织内两种不同蛋白质的表达、定位和示踪．由于大多数双光子显微镜一次只能提供一种波长的激发光,双色同时成像较难实现．mAmetrine和mKate2作为新发现的荧光蛋白对可以用于双光子双色同时成像,这得益于它们各自的优势：mAmetrine的斯托克斯位移和mKate2的高亮度．在765nm的波长激发时,它们的双光子吸收效率都很高．mAmetrine和mKate2能够很好地用于双色双光子活细胞成像实验．     

倒置双光子显微镜的使用与维护

双光子激发荧光显微是一种非线性光学显微技术,它结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术,具有高时空分辨率、高信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点。介绍了双光子显微镜的软硬件组成和技术参数,样品制备方法,双光子图像采集的常用操作规程,日常维护和仪器管理等方面。旨在为双光子仪器的使用者与管理者提供参考,使之更好地服务于教学与科研。     

强脉冲光作用下皮肤组织结构改变的实验观察及模拟

使用强脉冲光源(IPLs)作用于小鼠皮肤上,分别用普通显微镜、双光子显微镜(TPELSM)观察、分析在IPLs作用前后及不同能量密度下皮肤组织的结构.基于pennes生物传热方程,计算光子在皮肤组织中传输所吸收的热量引起组织升温达到的温度,与实验结果相吻合.     

光生物学与光医学中的新技术及其应用

近几年内,光子生物学与光子医学发展非常快,本文主要从四个方面介绍了近期内在光子生物学与光子医学领城内取得的重要进展：(1)双光子技术,可检测胚胎活组织、确定生物的非损伤激发光阈值、对人体肌纤维进行三维成像;(2)光镊技术,用于研究细胞的应变能力、细胞膜的弹性、跟踪并描述单个分子之间的结合以及操纵DNA分子;(3)光学探针技术,检测疾病、研究构象变化;(4)光学成像技术,主要集中介绍对肌动蛋白的成像方面。     

双光子激发荧光各向异性度的成像

荧光各向异性度 (fluorescence anisotropy) 测量可以获得荧光分子的转动速度信息,进而了解分子质量、结构、以及与周边环境的相互作用情况 . 围绕一台双光子激发扫描荧光成像系统,通过改变外光路和图像记录与处理程序,从而实现了双光子激发荧光各向异性度成像,并针对一些典型样品和体系,展示了该方法的应用 . 实验中观察了 FITC 荧光分子、 FITC 结合的 CD44 抗体分子及与肿瘤细胞表面受体结合的 FITC-CD44 抗体分子 . 测量结果表明,不同分子质量、不同微观环境状态下的荧光分子,其各向异性度大小不同,在各向异性度图中能够被明显区分 . 荧光各向异性度成像能够定量测量样品微区的各向异性度值,并以二维图像的形式直观表达,是各向异性度测量与成像技术的良好结合 .     

酪氨酸水溶液的闪光光解

酪氨酸和其他两种芳香族氨基酸——色氨酸和苯丙氨酸构成了各种蛋白质的生色团,它们是蛋白质吸收光能的主要部位,从这个意义上讲,生色团氨基酸的光解反应是了解蛋白质光化学的基础。虽然对酪氨酸水溶液的早期闪光光解研究就已表明光电离是主要的原初过程,但是直到近年来的激光光解研究才使我们对光电离的机制有了一些了解。酪氨酸的光解可以用下面的反应式表示:在碱性条件下(pH>9),酪氨酸酚基上的OH基解离,形成负离子,其光电离由反应式(2)表示:光解反应的原初产物对位α-氨基丙酸苯氧自由基缩写为(?)yr)的产生是经过单光子过程还是双光子过程?很多作者研究了这个问题,目前仍然存在一些分歧。所谓单光子过程,是指分子吸收一个高能光子后直接电离,或者形成的激发态迅速分解。而在双光子过程中,光解产物的形成经过两个步骤:吸收第一个光子后分子跃迁到一个中间态,然后中间态分子再吸收第二个光子而电离。本工作用闪光光解方法直接观察了原初光解产物(?)yr的产额与闪光绝对强度(即每次闪光射入样品池的光子数)的依赖关系,并结合理论分析,说明酪氨酸在碱性水溶液中的光电离是单光子过程,而在中性或弱酸性水溶液中是双光子过程。本工作还证实在碱性水溶液中酪氨酸原初光解产物(?)yr的产额与水合电子的产额相等,从而说明在碱性条件下光电离是产生(?)yr的几乎唯一的途径。除此之外,我们还对光解产生(?)yr的量子产额,这个瞬态产物的摩尔消光系数及其衰变的速率常数进行了测定。     

生物分子的双光子激发发光

应用Nd:YAG激光器和光学光谱分析仪对蛋白质分子的同时吸收双光子过程作了进一步研究,讨论了蛋白质分子双光子过程的特性和估计了它们的双光子吸收截面,并得到胰蛋白酶,白蛋白和色氨酸等分子由于双光子激发产生的荧光光谱.     

生物光子学应用

生物光子学是光学技术与生命科学的交叉学科,可以在分子水平上研究细胞的功能和结构,包括生物系统的光子辐射以及这些光子携带的信息,用光子及其技术对生物系统进行检测、加工和改造等。激光扫描共焦显微术、双光子荧光显微术、近场光学扫描显微术和光镊等显微技术在生命科学研究中的应用非常重要。     

二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况

目的:用二次谐波成像结合双光子荧光成像的方法观察人源胶原蛋白透皮吸收的情况。方法:将荧光标记的人源胶原蛋白(1 mg/mL)涂抹于小鼠表皮层经皮肤吸收1 h后用背向二次谐波观察皮肤内胶原纤维作为真皮层定位标志,用双光子扫描共聚焦显微镜观察人源胶原蛋白透皮吸收深度,吸收方式。结果:二次谐波成像结合双光子荧光成像表明人源胶原蛋白透皮吸收1 h后可观察到荧光信号沿着毛囊聚集,并有部分荧光分子由毛囊扩散至真皮层。结论:二次谐波可以更快速,更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维,以此作为检测物质透皮吸收深度的定位标志,具有不受荧光信号干扰的优点。人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层,并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。     

双光子显微镜在生物医学中的应用及其进展

光学显微镜的发展历史是一段不断提高显微镜的分辨率和对比度的历史。双光子显微镜是近30年来非线性显微镜的研究发展的代表。它在分辨率上与共聚焦显微镜相当,但在成像的层析穿透深度上有显著提高,并且大大减少了光毒性与光漂白。由于生物细胞组织中富有各种自家荧光源,因此双光子显微镜被广泛应用于皮肤组织甚至癌组织以及细胞的成像。基于共聚焦扫描显微镜的双光子显微镜可以很容易的与二次谐波显微镜组合,对皮肤组织中的重要成分胶原纤维进行成像。双光子显微镜还可以结合其他非线性光学现象对组织以及细胞进行成像,显示其强大的生命力。将来随着携带方便且廉价的双光子显微镜的出现,双光子显微镜有望在临床医学上发挥其有效的作用。     

生物组织背向SHG和TPEF的影响因素

由于生物组织的复杂性和多样性,以及样品制备等因素的影响,实验观察到的生物组织的背向二次谐波(second harmonic generation,SHG)和双光子激发荧光(two-photon excitation fluorescence,TPEF)效应的差异较大。以鼠尾组织作为实验对象,共40个切片,分为横向和纵向、HE染色和未染色四组,采用飞秒激光器作为激发光,用双光子激光扫描共焦显微镜(two-photon laser scanning confocal microscope,TPLSCM)观察和分析了样品在不同的制备方式、激发波长、激发功率、扫描深度等条件下的背向SHG和TPEF的变化曲线,讨论和比较了生物组织的背向SHG和TPEF的影响因素以及二者之间的异同,并尝试对实验现象做出了一定的解释。     

非线性光学显微镜观察肝脏纤维化的实验研究

目的:了解非线性光学显微镜在肝纤维化成像及定量分析研究中的地位。方法:分别用前向二次谐波(SGH)及背向双光子荧光(TPEF)对肝脏标本的成纤维胶原(Ⅰ/Ⅲ)和肝细胞浆进行成像,将结果与传统的Masson’s三染色法进行比较。随后用非线性光学显微镜对不同肝纤维化阶段的大鼠肝脏标本成像,并对图像进行统计分析。结果:(1)用二次谐波成像的肝内成纤维胶原分布图较传统的方法更清晰,易于进一步定量分析;(2)双光子荧光信号可以清晰的显示肝细胞形态;(3)非线性光学显微镜得到的肝纤维化图像易于用软件进行定量分析。结论:非线性光学显微镜是研究肝纤维化进程的灵敏、准确、快速、简单、客观的新方法。其对肝纤维化的定量分析具有重要临床意义。     

利用双光子显微镜检测活体动物脑内 Ca2 +动态变化

利用正置双光子显微镜系统和荧光探针标记技术,观察脑内Ca2+分布,建立测量活体动物脑内Ca2+动态变化的实验方法。制作活体动物颅骨开窗样本,脑内负载Ca2+标记物Oregon Green 488 BAPTA-1和星型胶质细胞标记物Sulforhodamine 101,利用双光子显微镜分别检测神经元和星型胶质细胞内Ca2+分布和动作电位引起的Ca2+瞬变。结果显示双光子显微镜可探测到脑内250μm处荧光信号,图像清晰且信噪比高,并能实时检测神经元和星型胶质细胞内Ca2+信号的动态变化。活体脑内Ca2+检测技术平台的建立为基础研究和医药应用提供了在体实验依据。     

2014年诺贝尔化学奖

<正>瑞典皇家科学院决定将2014年诺贝尔化学奖授予Eric Betzig、Stefan W.Hell和William E.Moerner以表彰他们发明了超高分辨率荧光显微镜。超越光学显微镜极限——超高分辨率荧光显微镜的发展通过纳米显微镜(nanoscopy),科学家们可以在细胞中观察到单个分子的运动。他们可以看到活细胞中的单个分子。他们可以看到在脑的两个神经细胞之间如何产生突触;能够在导致帕金森病和亨廷顿舞蹈病的蛋白质聚集时观察它们;可以在受精     

多光子显微镜在研究阿尔茨海默病中的应用

多光子显微镜采用近红外线激发荧光成像,能直接观察AD老年斑的自然病理进展,并且在鼠模型中进行抗老年斑治疗的疗效评估.其高分辨率的特点,可用于监测蛋白与蛋白之间、蛋白构象改变和蛋白水解而产生的荧光共振能量转移(FRET)改变.     

活细胞内5-羟色胺可见荧光的多光子激发成像

应用多光子激发激光扫描显微镜对5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）孵育的大鼠粘膜型肥大细胞进行自发荧光成像,首次观察到了活细胞内5-HT相关的可见荧光,并对其产生机理进行了初步探讨.实现了对活细胞内5-HT空间分布的高分辨成像,为研究活组织或细胞内5-HT的空间分布和含量与细胞功能状态的关系提供了新的实验方法.     

双光子显微成像系统群延迟色散的测量和补偿

为了对双光子显微成像系统的群延迟色散进行校正,提高双光子激发效率的目的,采用自相关仪测量的方法在自行搭建的双光子系统光路的四个位置测量飞秒激光的脉冲展宽情况,测量样品位置5个波长下最优的群延迟色散补偿值,由此拟合得到自搭建双光子系统的全波段群延迟色散补偿曲线。实验结果表明在应用此群延迟色散补偿曲线后样品位置的脉冲宽度平均减小95 fs,在两个典型激发波长(750 nm和900 nm)生物样品的荧光强度分别提高了42.7%和76.8%。结论为双光子激发效率与飞秒激光的脉冲宽度成线性反比关系。