三疣梭子蟹脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白基因的克隆及表达模式分析

脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)作为一种模式识别受体在甲壳动物的先天免疫中占有重要地位。利用SMART RACE技术,从三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血细胞中克隆得到一条LGBP基因。该基因cDNA序列全长为1378bp,包括1095bp的开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,在基因的5'端还含有138bp的非编码区(UTR),3'端含有144bp的UTR。预测的成熟肽相对分子质量为39825.24k,等电点为4.49。同时,用生物信息学方法对该基因的序列和二级结构进行了初步分析。RT-PCR结果显示:LGBP基因在被检测的组织,包括血细胞、肝胰腺、心脏、鳃和肌肉中都有表达。用金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激三疣梭子蟹后,发现在实验48h内,混合细菌刺激组血细胞中LGBP基因的表达量明显高于生理盐水对照组,推测该基因在抵抗细菌感染的免疫过程中发挥着积极的作用。     

三疣梭子蟹Profilin基因全长cDNA的克隆与表达分析

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究免疫基因的功能和作用机制,可为三疣梭子蟹养殖病害的防治奠定基础。本研究从三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库中克隆了742 bp 的profilin基因全长cDNA。Profilin全长cDNA中开放阅读框长375 bp,编码125 aa。推导的三疣梭子蟹profilin理论等电点pI 5.87,氨基酸序列与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）profilin同源性最高,序列一致性为42.9%。荧光定量RT-PCR分析结果显示在正常的三疣梭子蟹机体中,血细胞profilin表达水平最高,其次为肝胰脏;在致病菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）诱导后,血细胞中profilin表达量显著上升（P<0.01）,表明profilin可能参与了三疣梭子蟹的免疫防御反应,是一个免疫相关因子。     

三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长cDNA克隆与组织表达

旨在探讨三疣梭子蟹高度不饱和脂肪酸自身合成能力,探究三疣梭子蟹HUFA生物合成途径。采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到三疣梭子蟹△6去饱和酶cDNA全长序列,并利用荧光定量PCR技术进行肝胰腺、肠道、鳃等8种组织的表达分析。通过分析序列表明,基因序列全长2875bp,其中5'非编码区长465bp,3'非编码区长1078bp,开放阅读框(ORF)长1332bp,编码443个氨基酸;并且编码的蛋白序列具有典型的去饱和酶特性:3个组氨酸保守区,一个N端细胞色素b5结构域以及一个血红素结合的HPGG结构域。荧光定量PCR结果显示,Δ6脂肪酸去饱和酶基因在三疣梭子蟹多个组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次是肠道和肌肉,心脏中表达最少。结果表明三疣梭子蟹具有△6去饱和酶。     

脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因的克隆及表达分析

应用RACE技术克隆脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因, 并通过攻毒实验揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因的先天免疫防御作用, 为脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的免疫防治研究提供依据和思路。研究成功克隆了脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因全长cDNA序列, 该大亚基cDNA全长 2192 bp, 开放式阅读框长 2034 bp, 5′非编码区长 21 bp, 3′非编码区长 137 bp, 将该基因命名为 EcHcL。EcHcL编码 667 个氨基酸, 前 21 个氨基酸组成信号肽, 推测成熟肽的分子量为 78.5 kD。Blast比对结果显示, 由脊尾白虾血蓝蛋白EcHcL序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别达到 87%、73%, 其M结构域氨基酸序列与斑节对虾、日本对虾等物种同源性性高达 90% 左右, 由此推断该cDNA序列属于血蓝蛋白家族。组织表达分析结果显示, EcHcL基因在脊尾白虾鳃、卵巢、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、胃、腹神经节、眼柄、血细胞中均有表达, 肝胰腺中相对表达量最高。Real-time PCR分析发现EcHcL基因在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后脊尾白虾肝胰腺和血细胞中的表达量显著增加, 并具有不同的时空表达模式, 推测脊尾白虾EcHcL基因在免疫防御中具有重要作用。     

三疣梭子蟹NF-κB家族基因Relish和Dorsal的克隆及表达特征

为研究Relish和Dorsal在三疣梭子蟹免疫过程中所起到的作用, 研究利用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹Relish(Pt-Rel)、Dorsal基因(Pt-Dor) cDNA全长, 并通过实时荧光定量PCR技术分析了Pt-Rel和Pt-Dor基因在健康蟹不同组织及其原代培养的血淋巴细胞在感染不同微生物后的表达情况。结果显示, Pt-Rel cDNA长3254 bp, ORF长2949 bp, 编码983个氨基酸, Pt-Dor cDNA长2348 bp, ORF长1911 bp, 编码637个氨基酸; 蛋白结构预测分析发现Pt-Rel和Pt-Dor均包含RHD (Rel homology domain)及IPT (Immunoglobulin-like fold, Plexins, TranscriPtion factors)Rel/NF-κB家族蛋白经典结构域。Pt-Rel和Pt-Dor与其他节肢动物Relish、Dorsal氨基酸序列具有很高的相似性; 在系统进化分析中Pt-Rel和Pt-Dor分别与中华绒螯蟹等甲壳动物的Relish、Dorsal聚在一支, 而昆虫类聚在另一支。Pt-Rel和Pt-Dor在检测的6种组织中均有表达, 且2个基因均在血淋巴细胞中表达量最高。蟹血淋巴细胞体外感染实验结果表明, 不同病原微生物对2个基因表达的影响非常相似, 假丝酵母在2h明显诱导了Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达, 而金黄色葡萄球菌及溶藻弧菌在感染4h后使Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达显著上调。上述研究结果表明Pt-Rel和Pt-Dor基因很有可能参与了三疣梭子蟹的抗感染免疫过程。     

三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用, 实验采用SMART RACE方法, 克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp, 开放阅读框(ORF)为2298 bp, 预测其编码1个含有765个氨基酸的蛋白质。结构域分析显示, 该蛋白质包含UBL、PHD、TTD、SRA、RING finger 5个功能结构域。同源分析表明, 三疣梭子蟹PtUHRF1的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。qRT-PCR结果显示, PtUHRF1基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达, 但在精巢中表达量显著高于其他组织。该基因在胚胎和幼体发育不同时期表达差异显著, 在受精卵中的表达量最高, 并显著高于胚胎发育其他时期, 是多细胞时期表达量的2.5倍。PtUHRF1基因在性腺发育不同时期表达存在显著差异, 在卵巢II期表达量达到峰值, 之后逐渐下降; 在精巢Ⅰ期的表达量最高, 随着精巢发育逐渐下降。实验结果表明, PtUHRF1参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控, 为进一步深入研究该基因在三疣梭子蟹及甲壳动物生长发育中的作用提供参考。     

三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因克隆鉴定及在盐度胁迫下的表达分析

为研究Na+/H+-exchanger基因在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）盐度胁迫过程中的功能作用,克隆了三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因并进行表达分析。结果显示,Na+/H+-exchanger基因（GenBank:KU519329）全长4233 bp,5和3非编码区（UTR）长分别为519和753 bp,开放阅读框（ORF）长2961 bp。编码986个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为110.8 kD和7.42,具有信号肽和典型的Na+/H+-exchanger蛋白结构域,含12个跨膜螺旋;三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因与普通滨蟹（Carcinus maenas）同源性最高,达到87.2%,系统进化分析也显示该序列与普通滨蟹聚为一支;表达分析显示,三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在鳃中表达量最高;在低盐（盐度5、10和20）胁迫过程中,Na+/H+-exchanger基因在0-12h上调表达明显,在24-168h间表达量呈下降趋势;在高盐（盐度50）胁迫初期（0-12h）,该基因表达量相对稳定,之后（24-168h）显著下调表达。研究表明低盐显著诱导Na+/H+-exchanger基因的高表达,推测三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在低盐环境下发挥重要的渗透调节功能。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Wnt9α基因的克隆与表达分析

Wnt信号通路已被证实在细胞增殖分化、胚胎发育等多方面起重要作用,Wnt基因家族是重要的调节因子。为了了解更多的无脊椎动物Wnt基因相关的信息,本研究首次克隆并鉴定了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中的Wnt9α基因,命名为Lv Wnt9α,其基因全长c DNA为1 845 bp,包含长度为1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码460个氨基酸,包括一个信号肽和一个Wnt1结构域。实时荧光定量PCR(RT-PCR)分析表明Lv Wnt9α在被检测的所有组织中都有表达,其中在眼柄、肝胰腺、后盲囊、胃的表达量较高。白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)感染后,凡纳滨对虾血液中Lv Wnt9α基因的表达量呈先上升后下降趋势,在感染后48 h达到最高。革兰氏阴性菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染后,凡纳滨对虾血细胞中Lv Wnt9α基因表达量均在24 h达到最高水平,分别为对照组表达量的6.8倍和6.2倍。所有实验结果表明,Lv Wnt9α基因可能参与凡纳滨对虾先天性免疫应答途径。     

脊尾白虾组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

根据本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞全长cDNA文库获得的EST序列,利用RACE技术克隆获得脊尾白虾组织蛋白酶L基因的cDNA全长,命名为EcCatL基因.该序列全长1136 bp,包括5'非编码区24 bp,开放阅读框960 bp和3'非编码区152 bp,开放阅读框共编码319个氨基酸,预测相对分子量为35.30×103,理论等电点为5.27.同源性分析表明,脊尾白虾组织蛋白酶LEcCatL氨基酸序列与其它甲壳动物高度保守,与变色小长臂虾(Palaemonetes varians)及北极甜虾(Pandalus borealis) CatL的同源性分别为92％和76％.系统进化分析表明,EcCatL基因氨基酸序列与变色小长臂虾的CatL聚为一支.荧光定量PCR分析结果表明,EcCatL基因在血细胞、鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢、肠、胃及眼柄中均有表达,其中肝胰腺中的相对表达量最高.感染鳗弧菌及WSSV后6h和12h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中EcCatL的表达量较对照组均极显著增加(P＜0.01),且具有明显的时间差异性,表明EcCatL基因在脊尾白虾免疫反应中具有重要作用.     

三疣梭子蟹腺苷酸转移酶(ANT)基因的克隆与分析

腺苷酸转移酶(Adenine nucleotide translocase,ANT)是线粒体内膜上负责能量分子传导的转运蛋白,在能量代谢中起着关键作用。为了研究ANT基因在甲壳动物蜕皮中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE技术)克隆得到三疣梭子蟹ANT基因的序列全长(Gen Bank登录号:KM921660),该序列全长1 414 bp,包括132 bp的5'端非编码区,352 bp的3'段非编码区,具有930 bp的完整开放阅读框(ORF),编码309个氨基酸。将该ANT基因序列推导的氨基酸序列与已公布的其他物种ANT序列进行系统进化树分析发现,三疣梭子蟹ANT基因与其他甲壳动物ANT基因聚为一支,其中与拟穴青蟹ANT一致性高达96%。通过氨基酸序列比对发现,三疣梭子蟹ANT序列具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域,是形成能量分子传导的转运通道,催化细胞质中ADP和线粒体内ATP间进行跨膜交换。采用实时荧光定量PCR技术,分析三疣梭子蟹ANT基因的组织差异表达,结果表明ANT基因在三疣梭子蟹肌肉(Ms)中的表达量最高,在其他组织中表达量均较低,具显著差异(P0.05);在三疣梭子蟹蜕皮周期中,肌肉中ANT基因的表达量A期最高(P0.05),然后下降,至C期最低,随后又逐渐上升至D1期,在D1期出现第2个峰值后再逐渐下降。研究结果说明ANT基因与三疣梭子蟹肌肉活动密切相关,可能在蜕皮调控中发挥重要作用。     

Cloning and expression pattern analysis of a lipopolysaccharide -and beta-1,3-glucan-binding protein in Portunus trituberculatus

The lipopolysaccharide -and beta-1,3-glucan-binding protein (LGBP) is a pattern recognition receptor, which is fundamental for the innate immune response of crustaceans. A LGBP gene was cloned from the haemocytes of Portunus trituberculatus using SMART RACE methods. The full-length LGBP cDNA (1 378 bp) had a 1 095 bp open reading frame encoding a protein of 365 amino acid residues including a 16 amino acid residues signal peptide, a 138 bp 5' untranslated region (UTR) and a 144 bp untranslated region in the 3' UTR with a 29 bp polyA tail. The calculated molecular mass of the mature protein (349 amino acid residues) is 39,825.24 with an estimated pI of 4.49. The gene sequence and secondary structure of LGBP were analyzed by bio-informatics. Additionally, a Glyco hydro 16 domain was identified. The expression of P. trituberculatus in various tissues were detected through RT-PCR methods. The results showed that the LGBP gene expressed in all the tissues detected, including haemocytes, hepatopancreas, heart, gills and muscle. In response to the challenge of Staphyloccocus aureus and Vibrio alginolyticus, the LGBP gene expression in haemocytes of the group challenged with mixed bacteria were higher than the control group within 48 h. It suggested that the LGBP gene plays an active role in immunologic process against bacterial infection.     

Molecular characterization of a Ran isoform gene up-regulated in shrimp immunity

Diseases caused by viruses are the greatest challenge to worldwide shrimp aquaculture. Ran gene was an important antiviral gene identified from shrimp and its mRNA level was up-regulated in response to viral infection. In this investigation, a Ran isoform gene (named Ran-iso) cDNA was cloned from shrimp, Marsupenaeus japonicus. The full-length cDNA of Ran-iso was 1286 bp, including a 5′-terminal untranslated region (UTR) of 272 bp, 3′-terminal UTR of 366 bp and an open reading frame (ORF) of 648 bp encoding a polypeptide of 215 amino acids. The deduced protein was highly homologous, it shared 90.64%, 84.19%, 81.48% and 67.58% identities with Ran protein of shrimp, honey bee, human and tobacco respectively. Ran-iso gene was constitutively expressed in 6 tissues examined, including gill, hepatopancreas, hemolymph, heart, intestine and muscle. However, Ran-iso was highest expressed in hepatopancreas (p < 0.01), whereas the expressions of other five tissues were equal and relatively low. Time course analysis showed that the expression level of Ran-iso was obviously up-regulated 2.8 times (at 6 h) as much as that in the control in the hepatopancreas challenged by WSSV. This investigation might provide a clue to elucidate the shrimp innate immunity and would be helpful to shrimp disease control.     

罗氏沼虾Rab11基因cDNA克隆及其组织表达分析

为了发掘罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)免疫相关基因, 研究Rab蛋白(Ras-related proteins inbrain)在罗氏沼虾免疫应答中发挥的作用, 研究采用RACE-PCR技术克隆了罗氏沼虾Rab11基因全长cDNA序列, 记为MrRab11。全长1381 bp, 包括226 bp的5'UTR, 511 bp的3'UTR和645 bp的开放阅读框, 编码214个氨基酸, 含有一个Rab结构域。氨基酸序列比对显示, 罗氏沼虾与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、蚤状溞(Daphniapulex)、叶蝉(Homalodisca vitripennis) Rab11一致性分别为82%、83%和82%。软件预测, MrRab11编码的蛋白分子量约为23.75 kD, 等电点约为5.34。实时荧光定量表达分析表明, MrRab11基因在罗氏沼虾各组织中都有表达, 肝胰腺中的表达量最高, 其次是肌肉和肠道。在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)感染12h后, 罗氏沼虾肝胰腺中MrRab11的表达量上升, 显著高于对照组(P0.05), 推测这是MrRab11对阴沟肠杆菌的应激表达,MrRab11在肝胰腺中参与了罗氏沼虾免疫应答过程。     

A C-type lectin like-domain (CTLD)-containing protein (PtLP) from the swimming crab Portunus trituberculatus

C-type lectins play important roles in the non-self innate immune system of invertebrates. In this study, we isolated the full-length cDNA of the C-type lectin like-domain (CTLD)-containing protein, designated PtLP, from the hepatopancreas of the swimming crab Portunus trituberculatus, one of the most common edible crabs of East Asia. The PtLP cDNA consists of 923bp and encodes a polypeptide of 164 amino acids containing a well-conserved C-type lectin like-domain (CTLD). The deduced amino acid sequence of PtLP shows 29-36% amino acid sequence identity to other crustacean C-type lectin sequences. A phylogenetic analysis revealed that PtLP is in a large cluster together with black tiger shrimp PmAV, a gene involved in virus resistance of shrimp, and all of the C-type lectins from the various shrimps. Quantitative RT-PCR analysis showed that the PtLP mRNA was expressed highly in hepatopancreas and moderately in gills, hemocytes, and ovary of normal swimming crabs.     

斜带石斑鱼L-氨基酸氧化酶基因克隆及表达分析

鱼类的L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase, LAAO)具有广泛的抑菌杀虫效果,为了解斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)LAAO基因序列特征及其在刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染后的表达变化,该试验克隆得到2个石斑鱼LAAO基因:EcLAAO-1和EcLAAO-2,它们的ORF长度分别为1536和1569 bp,编码511和522个氨基酸,均含有氨基酸氧化酶(Amino_oxidase)结构域以及LAAO保守序列:DBM和GG motif。多重序列比对显示石斑鱼LAAO与其他鱼类LAAO具有较高的相似性。系统进化树分析表明,斜带石斑鱼的LAAO与硬骨鱼类亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测结果显示EcLAAO-1和EcLAAO-2在石斑鱼各组织均有表达,其中皮肤、鳃、胸腺、肝脏和肌肉中含量较丰富;在感染刺激隐核虫后,鳃和脾脏EcLAAO-1, EcLAAO-2表达量显著升高(P<0.05),这些结果暗示了石斑鱼LAAO参与先天性免疫,并在抗御刺激隐核虫感染中发挥重要作用。     

A thioredoxin response to the WSSV challenge on the Chinese white shrimp, Fenneropenaeus chinensis

Thioredoxin (TRX) is involved in cell redox homeostasis. In addition, it is responsible for maintaining proteins in their reduced state. In our study, a Fenneropenaeus chinensis thioredoxin (FcTRX) gene was identified from the Chinese white shrimp. The full length of FcTRX was 777 bp, including a 60 bp 5′ untranslated region (UTR), a 318 bp open reading frame (ORF) encoding a 105 amino acids protein, and a 399 bp 3′ UTR. FcTRX contained a TRX domain with a conserved motif of Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC). No signal peptide was predicted by SMART analysis. The molecular mass and pI of FcTRX were 12 kDa and 4.62, respectively. FcTRX is a widely distributed gene, and its mRNA is detected in hemocytes, hearts, hepatopancreas, gills, stomach, and intestine from an unchallenged shrimp. The expression level of FcTRX was the highest in hepatopancreas, where it was down-regulated to the lowest level at 12 h white spot syndrome virus (WSSV) challenge. In the gills, it went up to the highest level at 6 h. Western blot showed that FcTRX protein in hepatopancreas challenged with WSSV was down-regulated from 2 h to 12 h and then restored to the level similar to that of unchallenged shrimp at 24 h. In the gills challenged with WSSV, the FcTRX protein was up-regulated from 6 h to 24 h. Our research indicated its possible role in the anti-WSSV innate immunity of shrimps.     

赤眼鳟Mx1基因的cDNA克隆及表达特性

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)是否存在Mx1 (Myxovirus resistance)基因及参与抗病毒免疫反应, 研究利用RACE技术获得了赤眼鳟Mx1基因(ScMx1)的cDNA全长序列, 并对其进行了生物信息学分析; 采用荧光定量PCR技术, 检测了ScMx1在赤眼鳟健康组织中的表达情况以及感染GCRV后ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达特征。结果表明, ScMx1的cDNA全长为3000 bp, 包含5′非编码区124 bp, 开放阅读框1893 bp, 3′非编码区983 bp, 共编码630个氨基酸。预测的ScMx1蛋白包含GTP酶结合区域、中央核心结构域和GTP酶效应结构域。ScMx1与青鱼Mx1的相似性最高(97%), 与ScMx的相似性仅为50%。ScMx1在所检测的10种组织中均有表达, 其中在脾脏中表达量最高。经GCRV感染开始至168h, ScMx1和ScIFN-Ⅰ在肝脏和体肾中的表达量持续上调; 在脾脏和头肾中于感染后72h达到峰值。相关性分析显示脾脏中ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达水平呈显著相关(r=0.94, P=0.018)。研究发现赤眼鳟存在Mx1基因, 且可能参与了抗GCRV免疫应答反应。