人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

人白细胞介素－3基因翻译起始区的改造提高其在大肠杆菌中的表达水平

为了提高人白细胞介素－3(bhIL-3)在大肠杆菌中的表达,在计算机辅助下,设计合成了PCR突变引物,用于改造起始密码AUG上下游序列,并在不改变5’端氨基酸编码的前提下,尽可能选用大肠杆菌高频使用的密码子。将经改造后的Hil-3cDNA和翻译起始区置于PL启动子之下,转入大肠杆菌Tapl06,经42℃热诱导后．获得表达产物,提高表达水平近一倍,表达量达到菌体总蛋白量的30％左右。表达产物经Western blot验证,经PVDF膜转移后进行N端顺序分析,证明前15个氨基酸正确,产物经包涵体纯化后,纯度提高至80％以上,初步复性后能明显促进Hil－3依赖细胞的生长。     

大肠杆菌亮氨酰—tRNA合成酶基因表达和酶的纯化

在克隆含大肠杆菌氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因的３．２ｋｂＤＮＡ片段,并ｌｅｕＳ在大肠杆菌和中高表达提高３５倍的基础上ｌｅｕＳ改造,分别将两处不同长度的ｌｅｕＳ１和ｌｅｕＳ２分别构建在表达载体ＰＫＫ－２３３－２和ｐＴｒｃ－９９Ｂ中,其中ｌｅｕＳ１比ｌｅｕＳ２多一段１３０ｂｐ的３非翻译区。构建在表达载体ｐＴｒｃ－９９Ｂ中的基因片段ｌｅｕ３２可将酶的表达量提高１３５倍,经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＨＡ－     

重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白,植入小鼠肌肉内,第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成,第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验,２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性,糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．     

人白细胞介素—2基因在人骨肉瘤细胞系内表达

从ｐＨＩＧ５３质粒内切下人白细胞介素－２ｃＤＮＡ基因,并经中间一ｐＳＰ７２转换成与ｐＤＯＲ－ｎｅｏ载体相区域的酶切位点,然后将ＩＬ－２ｃＤＮＡ定向连接入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ载体,构建成功人ＩＬ－２逆转录病毒载体,经脂质体民入人骨肉瘤细胞系Ｍａ中,经Ｇ４１８筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中ＩＬ－２表达量,每１×１０＾５细胞２４ｈＩＬ－２表达量为５０－８００Ｕ,为骨肉瘤的基因治疗创造条件。     

重组人白细胞介素—3真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌的体内表…

将含有人白细胞介素－３基因ｃＤ－ＮＡ的真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌,观察ｈＩＬ－３基因在小鼠肌肉及体内的分泌表达情况。原位分子杂交及免疫组化结果显示注射重组质粒后,第１４天重组质粒全部进入到骨骼肌细胞内并有ＩＬ－３的表达。     

编码Synechococcus sp.PCC 7002 FNR中FNR区的基因克隆及其在大肠 …

用ＰＣＲ的方法克隆出了编码蓝细菌ＰＣＣ７００２ ＦＮＲ中ＦＮＲ区的基因克隆到达载体ｐＥＴ－３ａ上转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后实现了大量表达。重组ＦＮＲ组经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈｄｅｘ Ａ－５０离子交换层析及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶层析得到大量的电泳均一的ｒＦＮＲＤ。Ｎ末端氨基酸序列分析表明,表达产物确为ｐｅｔＨＬ所编码且起始Ｍｅｔ翻译后末被除去,ｒＦＮＲＤ与ｒＦＮＲ的吸收光谱相同,其黄递酶     

膜联蛋白VcDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术成功地从人胎盘组织中克隆了膜联蛋白Ｖ的ｃＤＮＡ,测序分析表明,与文献报道的核苷酸序列完全一致,交膜联蛋白Ｖ的ｃＤＮＡ克隆进Ｔ７启动子控制下的表达质粒ｐＥＴ－２４ａ（＋）中,经大肠杆菌ＢＬ１（ＤＥ３）后,经ＩＰＴＧ诱导可高效表达分子量为３６ｋＤ的膜联蛋白Ｖ蛋白,表达产物以可溶形式存在。表达产物占菌体总蛋白的３８％左右。表达产物经肝素亲和层析纯化后具有明显的延长部分凝血活酶时间的作     

重组人骨形成蛋白—3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％。目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽。表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽,经复性处理成可溶性蛋白,植     

T细胞中IL-3基因表达调节的转录因子初探

主要利用凝胶迁移率试验和抗体超迁移试验,以ｈＩＬ－３基因５′侧翼含κＢ位点的序列为探针,探究ＮＦ－κＢ是否参与了ｈＩＬ－３基因的表达调节．结果表明,在Ｊｕｒｋａｔ细胞和人外周血Ｔ淋巴细胞中,都存在与此序列特异结合的可诱导蛋白;ＮＦ－κＢｐ６５亚基的单抗对ＤＮＡ－蛋白复合物的形成没有影响．这些结果揭示：正常细胞和肿瘤细胞中,确存在可特异识别ｈＩＬ－３基因５′侧翼的κＢ顺序的蛋白因子,而且该蛋白因子的表达是可诱导的;但ＮＦ－κＢ并未参与ＩＬ－３基因的表达调节．     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

 为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性     

T7启动子作用下抗人TNF—α单链抗体的表达

基因工程技术构建的抗人ＴＮＦ－α单链抗体克隆人表达载体ｐＥＴ１５ｂ－Ｅｔａｇ中,在Ｔ７启动子的作用下,经０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的３８％,表达产物大部分以包涵体形式存在,而一小部分以有活性的可溶性形式出现于细菌的外周质中。     

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建,表达和？…

将化学合成的ＲＧＤ肽（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）编码寡核苷酸与尿激酶Ｂ链ｃＤＮＡ相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒ｐＢＶ２２０中,在ＰＲＰＬ自动子的作用下,经４２℃热诱导,在大肠杆菌ＤＨ５α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的９．２％,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,     

应用痘苗病毒为载体表达人白细胞介素4的研究

在真核细胞中表达近似于人类天然糖基化的白细胞介素４（ｈＩＬ－４）,为重要的研究课题。利用基因工程技术,以痘苗病毒作为载体,使之在真核细胞中表达ｈＩＬ－４,为生产糖基化的ｈＩＬ－４开辟新的可能途径。在痘苗病毒表达载体ｐＪ１２０质粒的基础上,组建了含有ｈＩＬ－４基因的ｐＪｌ２０／ｈＩＬ－４重组质粒,该质粒以痘苗病毒的胸腺嘧啶核苷激酶（ＴＫ）基因为侧翼序列,中间插入痘苗病毒的Ｐ１１和Ｐ２５两个转录方向相反的启动子,Ｐ２５的下游连接β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）基因,ｈＩＬ－４基因在痘苗病毒启动子Ｐ１１控制下进行表达,将ＰＪ１２０／ｈＩＬ－４质粒ＤＮＡ用脂质体转染法导入ＴＫ阴性的骨髓瘤细胞（ＴＫ１４３细胞）,与预先感染的痘苗病毒在细胞内进行同源序列重组,并且用病毒的核酸杂交鉴定证实,ｈＩＬ－４基因已重组到痘苗病毒基因组中,用ｈＩＬ－４应答细胞株检测病毒感染细胞上清,发现重组病毒感染的细胞上清中含有高滴度的ｈＩＬ－４活性,并对此种情况下ｈＩＬ－４产生的条件进行了动态观察。     

GPRP—scu—PA（144—411）的基因构建及其性质研究

本文将人工合成的编码ＧＰＲＰ四伏的寡核甙酸序列连接 ｓｃｕ－ＰＡｃＤＮＡ的５’端,并将它重组克隆到表达载体ｐＫＫＫ２３３－２中,在大肠杆菌中得到５％表达量。表达产物经亲和层析得到纯化,并测得其Ｋｍ为４０μｍｏｌ／Ｌ。体外纤咬继ＬＵＫ的２－３倍,对纤维蛋白的亲和性比ＬＵＫ提高了６倍,并且对纤维蛋白原的亲和力很低。     

GPRP－scu－PA（144－411）的基因构建及其性质研究

本文将人工合成的编码ＧＰＲＰ四肽的亥核苷酸序列连接至ｓｃｕ－ＰＡ（１４４－４１１）ｃＤＮＡ的５’端,并将它重组克隆到表达载体ｐＫＫ２３３－２中,在大肠杆菌中得到５％的表达量。表达产物经亲和层析得到纯化,并测得其Ｋｍ为４０ｍｏｌ／Ｌ。体外纤溶效率为ＬＵＫ的２－３倍,对纤维蛋白的亲和性比ＬＵＫ提高了６倍,并且对纤维蛋白原的亲和力很低。以上结果表明ＧＰＲＰ四肽可以提高尿激酶对纤维蛋白的专一亲和性。     

蓝细菌Synechococcus sp.PCC7002petH基因的高效表达及其产物的纯化

铁氧还原白－ＮＡＤＰ＾＋氧还酶（ＦＮＲ）是光合电子传递中的关键酶之一。蓝细菌Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７００２中编码ＦＮＲ的ｐｅｔＨ基因被克隆到表达载体ｐＥＴ－３ｄ上,在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占大肠杆菌总蛋白的５０５％以上。高效表达的产物以可溶性和包含体两种形式存在。可溶性部分具有ＦＮＲ的酶活性,在经过离子交换和凝胶层析后产生了电泳纯的ＦＮＲ。包含体形式的部分经６．７ｍｏ     

牛生长激素基因的人工合成,重组克隆及高效表达

本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子,人工全合成３２个寡聚核苷酸片段;连接并克隆获得Ａ（２７８ｂｐ）、Ｂ（８８ｂｐ）、Ｃ（２２４ｂｐ）３个较大ＤＮＡ片段;经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆;双向ＤＮＡ序列测定分析表明获得了两种人工全合成牛生长激素（ｂＧＨ）编码基因,即编码Ｎ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－ｂＧＨ和Ｎ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－ｂＧＨ的两个基因,而至今尚未见有人工全合成ｂＧＨ基因的报道。构建了在ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下含上述合成基因的表达质位ｐＢＬｂＧＨＥ７Ａ１和ｐＢＬｂＧＨＥ８,并在大肠杆菌中进行了温敏诱导表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物占全菌蛋白的３７％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析和纯化产物的Ｎ端氨基酸序列测定结果都表明上述两种人工全合成ｂＧＨ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量为现今国际文献报道的高限水平。     

cIts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体

从噬菌体λＤＮＡ（ｃＩｉｎｄｌｔｓ８５７Ｓａｍ７）克隆出９９０ｂＰ的ｃＩｔｓ８５７基因,经缺失,点突变等修饰改造和ＤＮＡ序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型ｃＩｔｓ８５７基因（７７０ｂｐ）。进而利用它构建大肠杆菌表达载体ｐＢＬＭＶＬ２和一套含３种不同阅读框架ｌｉｎｋｅｒ区的表达载体ｐＢＬＭＦＶ４、５Ｂ、６。上述表达载体;用于表达人工合成的牛生长激素（ｂＧＨ）、人干扰素－γΔＣ－１３和酵母ｐｈｏ８５等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。这些表明,克隆、修饰并组建到表达载体中的λ噬菌体ｃＩｔｓ８５７基因表达出具有功能作用的转录阻遏蛋白,使上述ＰＬ启动子控制下的大肠杆菌表达载体可经温敏诱导而高效表达外源基因产物．     

人γ心钠素在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术扩增人γ心钠素（γ－ｈＡＮＰ）ｃＤＮＡ编码序列,在其５′和３′端分别引入ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ限制性内切酶位点,定向克隆到表达质粒载体ｐＭＳ－３１ｂ,在大肠杆菌ｐｏｐ２１３６中高效表达出人γ心钠素融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的３０～４０％。双向免疫扩散法测定证明表达产物与人α心钠素（α－ｈＡＮＰ）抗血清呈阳性反应,纯化的表达产物经复性处理后能引起大鼠胸主动脉条舒张．