人I型胶原基因第一内含子调节转录的研究

人Ｉ型胶原α１（Ｉ）链（ＣＯＬＩＡ１）基因内含子序列在不同细胞内有不同的转录调节活性,报道了含人ＣＯＬＩＡ１基因内含子Ｉ不同区段（＋５４４～＋８５５和＋８２０～＋１０９３）的重组质粒ｐＳＣＥＰ－ＣＡＴ和ｐＳＣＩＰ－ＣＡＴ的构建并转染人胚肌腱成纤维细胞和Ｔｃａ８１１３舌癌细胞,地高辛标记抗ＣＡＴ－ＥＬＩＳＡ检测结果显示：ｐＳＣＥＰ－ＣＡＴ在两种细胞均获表达;ｐＳＣＩＰ－ＣＡＴ在人成纤维细胞未表达,但     

狂犬病毒aG株糖蛋白在pET原核系统中的表达及纯化

在狂犬病的临床诊断和基础研究中都迫切需要大量纯度高且价廉的狂犬病毒糖蛋白抗原。本文应用带有Ｈｉｓ６尾的ｐＥＴ原核表达系统对狂犬病毒（ＲＶ）ａＧ株的糖蛋白（ＧＰ）进行表达和纯化。构建的融合表达载体ｐＥＴ－ａＧ１和ｐＥＴ－ａＧ２（－５７ｂｐ）分别含有ＲＶａＧ株ＧＰ基因的全序列及删除了为ＧＰ信号肽编码的５８个碱基的序列。用ＳＤＳ 聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹、间接ＥＬＩＳＡ检测都证明表达产物为ＲＶＧＰ,且位于菌体中的包涵体内。经固定化金属螯合层析（ＩＭＡＣ）提纯,ｐＥＴ－ａＧ１表达产物有较高的特异性和纯度,可用作测定ＲＶＧＰ抗体的免疫诊断试剂。     

在酵母体内用RNA聚合酶II表达大肠杆菌tRNA^Sec基因

我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸ｔＲＮＡ基因（ＳｅｌＣ基因）连接到分泌型表达质粒ＰＶＴ１０２Ｕ－αＭＦＬ中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于ＳｅｌＣ基因的下游。将该质粒转化酵母,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,在ＳＤ液体培养基中检测出７￣８ｋｄ的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总ＲＮＡ用互补与该ｔＲＮＡ ＴψＣ茎环区的２１－ｍｅｒ寡核苷酸,经５＇标记后作为探针进行Ｎｏｒｔｈ     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

人T细胞白血病病霉Ⅰ型env基因的克隆与表达

本文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从整合有人Ｔ细胞白血病病毒Ⅰ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）的ＭＴ－２细胞株中,扩增出ＨＴＬＶ－Ｉ外膜蛋白（ｅｎｖ）的全基因（１．４５ｋｂ）,并成功地克隆入ｐＵＣ１９载体,构建成ｅｎｖ基因克隆ｅｎｖ／ｐＵＣ１９．利用原核高效表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,在大肠杆菌中有效地表达了与谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合的ｅｎｖ羧基末端抗原的重组蛋白,融合基因的转录由ｔａｃ启动子调控。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明,有一约５２ｋＤ的目的蛋白带,表达量占菌体总蛋白的１０％;ＷｅｓｔｅｒＮｂｌｏｔｔ及ＥＬＩＳＡ结果显示,表达产物能与ＨＴＬＶ－Ｉ多抗血清结合。本研究为研制ＨＴＬＶ－Ｉ的诊断试剂及进一步了解ｅｎｖ的免疫学和生物学性质打下了基础。     

促红细胞生成素基因表达载体的构建及其在CHO细胞中表达的研究

用从基因文库中所克隆的促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因,构建了３种由不同启动子调控的表达载体——ｐＯＰ１３／ＥＰＯ,ｐＲＳＶ／ＥＰＯ,ｐＣＭＶ／ＥＰＯ,在这３个表达载体的构建过程中对基因的转录起始效率、内含子的剪接、５′非翻译区和３′非翻译区对基因表达的影响等因素都加以考虑．用脂质体转染法分别将上述３个载体导入ＣＨＯ细胞,经瞬时表达,用ＥＬＩＳＡ方法检测,表达量分别为１９０ｍＩＵ／ｍｌ、１６０ｍＩＵ／ｍｌ、４４７ｍＩＵ／ｍｌ．用表达载体ｐＯＰ１３／ＥＰＯ转染ＣＨＯ－Ｋ１２细胞,在４００μｇ／ｍｌ的Ｇ４１８浓度下筛选稳定表达细胞克隆,获得了表达量约为１６０ＩＵ／１０６细胞（４８ｈ）的Ｃ１０细胞株．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现了ＥＰＯ阳性条带．用ＴＦ－１细胞对ＥＰＯ进行了生物活性检测,初步证实所表达的ＥＰＯ有生物活性．     

抗菌肽与碱性成纤维细胞生长因子基因的融合及其在酵母中的表达

从重组质粒ｒＢＳ上切下柞蚕抗菌肽Ｄ基因片段,切去终止密码后连接到重组穿梭质粒ｐＶＴ－ＧＦ上碱性成纤维细胞生长因子ｃＤＮＡ的５′端,使密码框正确排列,构建成融合基因重组质粒ｐＶＴ－ＣＤＧＦ,转化到酵母中进行表达。转化子酵母蛋白粗提物用Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１作指示菌进行抑菌圈测试,初步检出具有抑菌活性,用ＥＬＩＳＡ检测证明其具有碱性成纤维细胞生长因子的抗原性。     

抗菌肽与碱性成纤维细胞生长因子基因的融合及其在酵母中的表达

从重组质粒ｒＢＳ上切下柞蚕抗菌肽Ｄ基因片段,切去终止密码后连接到重组穿梭质粒ｐＶＴ－ＧＦ上碱上成纤维细胞生长因子ｃＤＮＡ的５′端,使密码框正确排列,构建成融合 组质粒ｐＶＴ－ＣＤＧＦ,转化到酵母中进行表达。转化子酵母蛋白粗提物用Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１作指示菌进行抑菌圈测试,初步检出具有换菌活性,用ＥＬＩＳＡ检测证明其具有碱性成纤细胞生长因子的抗原性。     

编码大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的基因（argS）拥？…

编码大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因（ａｒｇＳ）和编码亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）的基因（ＬｅｕＳ）分别插入ｐＵＣ１８后,各自在Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中的表达有很大的差异（高表达倍数分别为１０００和３５倍）。为了调查造成其表达差异的原因,用ａｒｇＳ的５＇上游非编码区取代ｌｅｕＳ的５＇上游非编码区,构建了融合基因ｐａｒｇ－ｌｅｕＳ;将它插入质粒ｐＵＣ１８     

Epstein—Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白     

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因,扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中,构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使ＤＥ 值降低,得到非还原糖或低还原糖。     

Nm23-H1/NDPK-A基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化的研究

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增人二磷酸核苷激酶Ａ亚基（ＮＤＰＫ－Ａ）基因,即ｎｍ２３－Ｈ１／ＮＤＰＫ－Ｋ基因的编码序列,经序列分析后,定向克隆于表达质粒载体ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达出重组人ＮＤＰＫ－Ａ．表达产物为可溶性的非融合蛋白,占菌体总蛋白４２％．斑点ＥＬＩＳＡ法鉴定表明表达产物与ＮＤＰＫ－Ａ标准抗血清呈阳性反应．以ＤＥＡＥ纤维素弱阴离子交换层析、ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ染料亲和层析结合高效液相排阻色谱技术纯化ｒＮＤＰＫ－Ａ,得纯度为９６．７％的目标蛋白．以反相高效液相色谱法进行酶活性分析,表明纯化的ｒＮＤＰＫ－Ａ能催化ＡＴＰ＋ＵＤＰ＝ＡＤＰ＋ＵＴＰ的反应,比活性为８００Ｕ／ｍｇ蛋白．     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＲ的方法扩增ｚｏｔ基因。序列分析表明,ｚｏｔ基因编码３９９个氨基酸,其中４个氨基酸与文献报道有差异。将ｚｏｔ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－２８（ａ＋）构建表达质粒ｐＥＴ－ＺＯＴ,转化大肠檑菌ＢＬ２１（ＤＥ３）筛有达菌株ＢＬＺＯＴ。表达菌株经１ｍｍｏｌ／ＬＴ ＩＰＴＧ诱导表达３－５ｈ后,表达大量ＺＯＴ蛋白,并形成包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组ＺＯＴ蛋白分     

LIF基因转染的ES细胞生长与分化特性的研究

我们将人Ｄ型ＬＩＦｃＤＮＡ以正反两种方向分别克隆到载体ＰＫＣＲ３,并引入ｎｅｏ基因,构建成ｐＳＶＬＤ和ＰＳＶＬＤ质粒,按磷酸钙沉淀法分别转染ＥＳ－５胚胎干细胞,,经Ｇ４１８和没浓度ＬＩＥ条件培液共同筛选,,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析以及ＥＳ－５细胞集落分化抑制能力测定,建立了过度表达分泌ＬＩＦ的ＥＳＬ（＋）细胞株和表达外源反义ＬＩＦＲＮＡ的ＥＳＬ（－）细胞株。我们发现,我们发现,ＥＳＬ     

Epstein-Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白联合免疫效果相似。不同启动子控制下的ＭＡ基因,诱发小鼠免疫应答无明显差异。     

小麦黄花叶病毒RNA228kDa蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据小麦黄花叶病毒（ Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ） 核苷酸序列测定结果,将 Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ２ 上的２８ ｋ Ｄａ 蛋白基因克隆到ｐ Ｅ Ｔ１１ａ 上,构建了原核表达载体ｐ Ｅ２８３９ 。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析表明,经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导,２８ ｋ Ｄａ蛋白基因在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）ｐ Ｌｙｓ Ｓ 中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,首次制备了小麦黄花叶病毒 Ｒ Ｎ Ａ２ 蛋白特异性抗血清。     

人促红细胞生成素基因组基因和cDNA的克隆及其在COS－7细胞中的表达

利用ＰＣＲ技术,从正常人胎肝染色体ＤＮＡ中克隆到长度为１５７２ｂｐ的人促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成１３ｂｐ外显子１的编码区,并与１５７２ｂｐ片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的ＥＰＯ基因插入载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ得到ｐＳＶ２－ＥＰＯ表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人ＥＰＯ单抗及兔抗人ＥＰＯ多抗,对表达产物进行ＥＬＩＳＡ定量测定,细胞分泌ＥＰＯ量高达２５１±７Ｕ／ｍｌ．Ｋｒｙｓｔａｌ法测得体外生物活性２４１．５±６．５Ｕ／ｍｌ．用ＥＰＯ单抗免疫沉淀结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了ＥＰＯ条带。从高效表达ＥＰＯ的转染细胞中分离纯化ｍＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆到ＥＰＯ的ｃＤＮＡ,这为ＥＰＯ在其它系统中的表达及ＥＰＯ的功能与结构的研究打下了基础。     

重组腺病毒介导的白细胞介素—12（IL—12）在肝癌细胞中的表达

利用腺病毒表达系统在肝癌细胞中成功地表达了有生物活性的白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）。ＩＬ－１２的Ｐ３５和Ｐ４０ ｃＤＮＡ分别克隆到腺病毒载体ｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡ,构建ｐＡＣ／Ｐ３５和ｐＡＣ／Ｐ４０表面质粒。与腺病毒重组质粒ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,通过基因重组产生ＩＬ－１２Ｐ３５和Ｐ４０重组腺病毒。用重组腺病毒感染肝癌细胞株ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１,经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ检测证明,     

蛇毒蛋白Echistatin的C端突变基因的构建,表达及其活性研究

通过ＰＣＲ定点突变的技术,将蛇毒蛋白Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ基因的Ｃ端进行了突变（Ａｌａ４８→Ａｒｇ４８→,Ｔｈｒ４９→Ｖａｌ４９）,模拟纤维蛋白Ｎ端的四肽（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ）,以期增加Ｅｃｓ（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）的活性,突变的基因重组到表达质粒ｐＪＣ２６４上,经ＩＰＴＧ诱导,以ＣｈｅＹ－Ｅｃｓ融合蛋白方式进行了表达,表达量占菌体总蛋白的１５￣２０％,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５初步纯化     

抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达

通过ＰＣＲ扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,以ｐＣｏｍｂ３为载体,在大肠杆菌ＪＭ８３中,ｓｃＦｖ未获得有效表达,而以ｐＥＴ－２２ｂ（＋）为载体的ｓｃＦｖ在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,３０℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白