利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑大鼠模型

RNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链引导RNA(sgRNA)与核酸酶Cas9构成。在细胞内,sgRNA能够按照碱基互补配对的原则引导Cas9与靶点结合,由Cas9切割目标DNA,造成双链DNA断裂(double stranded break, DSB)。在随后的DNA修复过程中,细胞主要进行非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或在有修复模板存在的情况下进行重组修复(homology directed repair, HDR)。如果将CRISPR/Cas9系统以及修复模板通过显微注射的方式导入大鼠的胚胎内,就能借助细胞的修复机制实现大鼠胚胎的基因编辑,由此构建各种基因修饰大鼠模型。本文详细介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠模型的具体操作步骤,以期为相关领域的科研人员提供一种大鼠基因修饰模型的构建方法。     

CRISPR基因编辑的脱靶效应应对策略综述

CRISPR/Cas9基因编辑系统是第三代基因编辑技术,在生物医学领域有着广泛的应用。该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成,sgRNA与Cas9结合并引导Cas9到达DNA靶点,Cas9作为核酸内切酶对靶序列进行切割,形成DNA双链断裂(double strand break, DSB)。DSB通过两种机制——非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重组介导的修复(homology-directed repair, HDR)——进行修复,实现特定基因的敲除或插入。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑工具相比,CRISPR/Cas9在简便性、专一性等方面有很大优势,但脱靶效应一直是它在实际应用中面临的一个难题。目前已有许多针对脱靶效应的研究,科学家们已发现一些影响靶点专一性的因素,如sgRNA种子序列、PAM序列、Cas9蛋白、DSB修复通路等,并据此研发出降低脱靶效应的可行性策略。本综述就CRISPR/Cas9系统的作用原理、潜在的脱靶危害和降低脱靶效应的策略研究进行阐述。     

同源重组及非同源末端连接修复途径介导的基因编辑:CRISPR技术的认知、应用及展望

CRISPR系统具有精确识别及剪切特异性DNA序列功能而被开发成一种高效的基因编辑工具。它以成本低廉、操作简便、效率高及通用性广等优势,成为新一代最具代表性的基因编辑技术。在应用中,CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂,继而诱导同源重组(HDR)或非同源末端连接修复(NHEJ),为基因组定向改造与调控带来了革命性的突破。该文将对近年来生物科学领域中发展迅猛的研究工具CRISPR/Cas系统进行介绍,包括其结构、作用原理、类型及应用等,并重点阐述同源重组或非同源末端连接修复途径介导的基因定向编辑技术及应用。     

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在作物育种中的应用

CRISPR/Cas基因编辑技术在植物基因功能研究和作物遗传改良方面具有重要应用价值,其主要依赖gRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂（DSBs）,DSBs在通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式进行修复时,会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换,从而实现基因编辑。介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的作用机理及发展趋势,并对CRISPR/Cas技术在主要粮食及经济作物育种中的应用进展进行了总结,以期为农作物育种提供有益的参考。     

动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的同源重组效率研究进展*

基因组编辑技术可以对DNA或RNA进行精准改造,极大地促进了生命科学的发展。CRISPR/Cas9系统在靶位点诱导DNA发生双链或单链损伤,细胞对损伤部位采用无供体模板的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或有供体模板的同源重组(homologous recombination,HR)修复。基于HR的基因组编辑策略通常被用于获得DNA的精准改造,而NHEJ在动物DNA损伤修复中起主导作用。为了提升HR效率,研究人员设计了多种方案,包括CRISPR/Cas9系统优化和DNA修复通路调控等。从DNA损伤修复途径、Cas9变体选择、sgRNA设计、供体模板设计、DNA修复途径相关蛋白功能调控、供体模板募集效率提升、细胞周期调控及编辑细胞生存效率提升等方面详细综述了相关研究成果,发现尚未开发出放之四海而皆准的HR提升策略,基于HR的基因组编辑需要针对具体案例制定个体化策略。旨在为动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的HR效率研究提供理论参考,为动物基因功能分析、基因治疗和经济动物基因编辑育种提供帮助。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的人类遗传疾病基因治疗相关研究进展

CRISPR/Cas9系统(常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统)为靶向基因编辑提供了强大的技术手段.利用序列特异性sgRNA的引导,CRISPR/Cas9系统能够精准地在目标DNA的确切位置导入双链切口.与已有的基因编辑手段相比,该系统具有更优异的简便性、特异性和有效性.目前,大量涉及体内外多物种的CRISPR/Cas9基因编辑研究已充分展示了该技术的巨大潜力,为基于该技术的疾病治疗研究和临床应用带来了希望.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术所介导的非同源性末端连接和同源性DNA修复作用,近期多个研究工作已经成功应用该技术修复了包括点突变和基因组缺失等在内的遗传疾病相关基因组缺陷.本综述将总结近期有关利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的相关临床前研究进展.     

DNA碱基编辑器在微生物中的研究进展

在众多生物中利用具有切割作用的CRISPR/Cas9系统与非同源性末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复系统或同源性末端连接(homology-directed repair,HDR)修复系统共同完成基因编辑工作都有报道。但是由于NHEJ的不精确性以及一些微生物中HDR效率较低导致生物体死亡限制了该工具的发展。基于CRISPR/dCas9系统构建而成的DNA碱基编辑器作为一种编辑工具,可靶向地实现碱基之间的转换,且不导致微生物死亡。DNA碱基编辑器在微生物中已经实现靶向编辑工作,可以同时多个位点进行编辑,同时可以利用该工具将编码氨基酸的密码子转化为终止密码子,提前终止翻译过程实现对基因的失活。本文主要对DNA碱基编辑器的作用原理,发展历程以及在微生物中的应用做了概述,最后提出了该工具存在的一些不足之处,并结合相关研究展望了未来的研究方向。为在微生物中开发与利用DNA碱基编辑的研究提供了思路。     

一种新型提高HDR效率的CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统

近年来，CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展，在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break, DSB)同源指导修复(homology-directed repair, HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略，但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略，并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donoradapting system, DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain, Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达，将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence, Gal4BS)作为受体序列与双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)供体结合，以期提高HDR效率。使用HEK293T-HDR.GFP报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100～60 bp)时该系统能够提高HDR效率2～4倍。进一步的优化研究表明...     

利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9)是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSBs),利用同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇(Drosophila melanogaster)CG4894基因进行了无缝编辑(seamless genome editing),成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine,Y)突变为半胱氨酸(cysteine,C),且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

碱基编辑系统研究最新进展及应用

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homology directed recombination,HDR)修复途径,且效率极低.基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合,构建了两套碱基编辑系统(...     

CRISPR/Cas9技术在生物医学领域的非病毒及病毒载体

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型基因组编辑技术,能够靶向干扰或修复基因组的特定基因.来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas9系统已经由生物学家发现或构建,Cas9核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的主要组成成分.该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘,基因功能的鉴定,动物模型的建立以及基因治疗药物的开发.CRISPR/Cas9系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症.然而,如何有效递送CRISPR/Cas9至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的挑战之一,这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力.本文主要综述Cas9mRNA,Cas9蛋白或编码Cas9基因及相应sgRNA载体的递送系统.递送Cas9蛋白的非病毒载体能够维持Cas9的靶向作用,减少脱靶效应;递送sgRNA和供体模板的病毒载体能够改进基因编辑及同源修复效率.安全,有效及可规模化生产的递送载体将会推进CRISPR/Cas9技术在人类基因治疗领域中的应用.     

人类胚胎单碱基编辑治疗遗传疾病的研究

基因编辑技术是当今生物学研究领域最为重要的颠覆性技术之一,以CRISPR/Cas9系统为核心的基因编辑工具被广泛应用于包括人类体细胞、生殖细胞编辑相关的医学研究领域。虽然CRISPR/Cas9系统可以高效编辑靶基因,但其精准编辑能力依赖于效率极低的同源重组方式,这极大限制了其定点编辑的能力与应用范围,所以寻找一种能高效引入点突变的新型基因编辑工具具有重大的应用价值。以CRISPR/Cas9系统为基础的单碱基编辑系统可以在基因组靶位点实现精准、高效的C/G和T/A碱基间的转换,其编辑能力已经在动植物、人体细胞以及人类胚胎中得到证实。利用单碱基编辑技术,有望对人类超过70%的相关遗传性致病位点进行修复。现就人类胚胎单碱基编辑治疗遗传疾病的最新研究进展进行综述和展望。     

基因修饰小鼠构建的革命:CRISPR/Cas9技术

基因修饰小鼠在研究人类疾病致病机理和治疗手段中起到了关键作用。传统的小鼠基因组编辑使用胚胎干细胞(ES细胞),虽然可以对内源基因进行精细的修改,但是复杂、繁琐并且耗时。近几年发展的人工核酸酶可以在靶位点切割DNA双链,诱发细胞内源性修复机制,发生同源重组修复或非同源末端连接,从而提高了基因组编辑的效率。从ZFN到TALEN再到CRISPR/Cas9技术,新型基因组编辑技术正以惊人的速度渗入到生命科学的各项研究工作中。将对新型基因组编辑技术进行介绍,着重阐述CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术在基因修饰小鼠中的应用,比较该系统与其他方法的优越性和不足,并对该系统进行展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在致瘤病毒感染研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9),CRISPR/Cas9〕基因编辑技术的发现源于真细菌和古细菌中CRISPR/Cas系统介导的适应性免疫机制研究。该技术利用特异性向导RNA识别靶点基因,引导核酸内切酶Cas9对其切割,并通过同源重组或非同源末端连接完成对目的DNA的编辑。某些病毒感染机体后,可将其基因组整合到宿主细胞基因组中或潜伏于组织中而无法被彻底清除,从而引起持续性感染。本文参考2013年以来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的最新相关研究报道,重点综述其在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV )、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)等致瘤病毒感染相关疾病研究中的应用,并概括其作用于这些病毒的有效靶点。     

CRISPR/Cas9系统中引导RNA的研究进展

CRISPR/Cas9系统作为重要的一种基因编辑工具,自产生以来广泛应用于各种生物体基因组序列的精确编辑,可在特定位点产生核苷酸的删除、插入或替换,从而改变编码基因的功能。以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术将应用于包括生物育种在内的各项生物技术领域,产生新一代生物技术产品。目前关于CRISPR/Cas9的研究报道多集中于Cas9蛋白的结构功能,以及CRISPR/Cas9系统的工作原理。引导RNA(Guide RNA)作为CRISPR/Cas9系统的重要组分之一,也是基因编辑技术领域的研究热点,近来有多篇文章报道通过改良引导RNA从而提高CRISPR/Cas9的编辑效率和精确性。对CRISPR/Cas9系统中的引导RNA研究进展进行了综述,围绕引导RNA的序列组成、结构特征以及转录产生方式这3方面内容,有助于全面了解CRISPR/Cas9系统的结构特征,讨论了引导RNA对CRISPR/Cas9基因编辑效率的影响,有利于CRISPR/Cas9系统的使用。最后,展望引导RNA今后的研究发展趋势,旨在解决CRISPR/Cas9目前存在的相关问题,优化出效率更高、精度更高的基因编辑技术。     

CRISPR/Cas9运输系统的研究进展及其在基因相关疾病方面的应用

CRISPR/Cas9系统是细菌体在长期进化过程中抵御病毒或噬菌体DNA的一种适应性免疫系统。尽管近年来的一些基因编辑技术,如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶等已经给基因编辑带来了许多便利,但CRISPR/Cas9系统以其独特的优势,给基因编辑领域带来了革命性的变化。CRISPR/Cas9系统在生物研究、基因相关疾病的治疗、疾病的基因水平研究等多方面都有广泛的应用。综述近年来CRISPR/Cas9运输系统的研究进展及其在基因缺陷疾病方面取得的应用成果,分析慢病毒和腺相关病毒运载基因编辑元件的利弊,并探讨CRISPR/Cas9系统在基因编辑效率方面的影响因素及仍然存在的问题。     

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

CRISPR-Cas9研究进展及在基因治疗上的应用

CRISPR-Cas9[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated （Cas）9]是近年兴起的一种高特异性和高效的基因编辑新技术,由向导RNA（single guide RNA,sgRNA）和cas9（CRISPR-associated 9）蛋白组成,引起DNA位点特异性双链断裂（double-strand breaks,DSBs）,引发同源重组修复（homology-directed repair,HDR）或非同源末端连接修复（non-homologous end joining,NHEJ）,达到靶基因修饰的作用。CRISPR-Cas9技术自发现以来,因其便于操作、花费较低、高特异性、可同时打靶任意数量基因等优点而被应用。近年研究显示,对于一些遗传性疾病,可通过CRISPR-Cas9精确的基因编辑破坏致病的内源基因、改正引起疾病的突变体或插入新的保护性基因进行治疗,该技术为基因治疗开启了一个新方向。主要从CRISPR-Cas9结构、作用机制及在疾病基因治疗上的应用等方面进行了综述。