水稻插入突变库构建研究进展

水稻是单子叶植物基因组研究的一种模式植物 ,其全基因组测序已经完成 ,在此基础上开展功能基因组的研究。水稻插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容 ,在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。水稻插入突变体库构建的方法有T DNA插入突变、Ac Ds系统插入突变、Tos1 7插入突变。分别介绍三种方法的原理及其在水稻突变体库构建中的应用和研究进展。     

不同粪便DNA提取方法比较分析北大核心CSCD

肠道微生物群落结构和多样性与人体疾病密切相关。然而,相关群落结构分析结果可能受到DNA提取质量等实验因素影响。因此,评估不同DNA提取方法对肠道特定种属的提取效果,对于全面、准确获取人体肠道微生物谱,深入探究肠道微生物群落结构具有指导意义。本研究旨在借助实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT qPCR)技术,以DNA提取纯度、浓度,以及对肠道中特定种属微生物基因组DNA的提取丰度为指标,对5种DNA提取方法进行比较分析。结果表明,试剂盒Q的提取效果最佳,特别是对乳杆菌属和双歧杆菌属等革兰氏阳性菌的提取效果较好。N试剂盒的平均DNA提取浓度较Q试剂盒低,但在纯度方面,二者无显著性差异。与其他3种商用试剂盒(M、PSP、TG)相比,N方法对肠道内指定微生物基因组的提取效果仅次于Q试剂盒,位居第二。相比之下,M试剂盒提取所得DNA,质量较高,但浓度偏低,对于肠道内革兰氏阳性菌的提取效果不很理想。TG试剂盒和PSP试剂盒提取所得DNA在浓度、质量以及细菌丰度方面均不及其他验证的试剂盒。综上,Q试剂盒可作为肠道微生态研究相关实验中获取高质量基因组DNA的提取方法。本研究结果为肠道微生态研究相关实验中基因组DNA提取方法的选择提供参考依据。     

煤地质环境微生物总基因组DNA提取方法的优化

高质量的DNA是进行分子生物学研究的基础。通过对传统DNA抽提方法(酚-氯仿法)进行改进,并以Rhodococcus sp.R04和煤粉为实验材料对细胞破碎条件进行优化,建立了一种可用于煤地质环境微生物基因组DNA高效提取的改良方法。以改良法和商业试剂盒提取煤地质环境微生物基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、细菌及古菌特异性片段的PCR扩增来评价所提取DNA的质量。改良法和试剂盒法均能获得煤地质环境微生物基因组DNA,并能用于多种特异性PCR扩增。与试剂盒提取的DNA相比,改良法获得的DNA片段主带明显,约占总DNA含量的50%,分子量大小接近23 kb,并且提取量大,约为试剂盒的5-10倍。同时,能用于如DNA文库构建和宏基因组测序等。此外,改良法所用试剂普通,价格便宜,提取的煤地质环境微生物基因组DNA质量较高,适于实验室和科学研究。     

枝干树皮宏基因组DNA的提取

旨在得到一种适用于提取多种枝干树皮的高质量DNA的方法。参考前人提取植物DNA的经验,综合了研磨时加PVP、缓冲液洗涤、SDS与CTAB结合使用、高浓度KAc低温冻融、高浓度Na Cl条件下异丙醇沉淀、DNA完全溶解后加微量RNase A处理等操作,所得5种基因组DNA浓度介于190-970 ng/μL,纯度都很高,皆能被限制性内切酶切割,都可用作模板扩增到细菌16S r RNA基因片段,以苹果树皮DNA为模板扩增到苹果BIP和PDI基因且苹果树皮基因组DNA经测序公司检测,质量满足高通量测序法研究微生物多样性对环境宏基因组的要求。     

一种从活性污泥中提取微生物总DNA的方法

对活性污泥的微生物群落进行研究的首要前提是获得大量的高纯度微生物基因组DNA。本文建立了一种高效、简便的提取活性污泥总DNA方法。从提取的核酸总量、纯度、基因组完整性等多方面对所得到的DNA质量进行了评价,结果表明,本法从单位活性污泥中提取的DNA得率为105-823μg/g,结构完整,纯度很高,无需进一步的纯化,可直接进行微生物群落分析及构建文库等后续分子生物学操作。现在实验室使用的提取活性污泥中DNA的方法,纯度普遍都无法达到PCR反应和建立文库的要求,本文建立的活性污泥DNA提取方法则可以克服这一难题。     

快速提取肠道微生物基因组DNA的方法

目的:肠道微生物的研究日益成为热点,如何获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA是肠道微生物研究中的关键。本文通过对酚/氯仿法提取总DNA过程进行考察和优化,建立一种简便酚/氯仿抽提法。方法:考察和优化酚/氯仿法提取总DNA的过程,并根据DNA产量、纯度以及ERIC-PCR及16S rNDA-RFLP所反映的微生物群落结构特性的指标,并与QIAamp?DNA Stool Mini Kit提取的进行比较,评价了所建立的快速提取方法。结果:用简便酚/氯仿法得到基本完整的基因组DNA,ERIC-PCR和16S rDNA-RFLP结果与QIAamp?DNA Stool Mini Kit法基本相同。结论:该方法快速并成本低,适合肠道微生物研究中总DNA提取,尤其适合处理大批量的样品。     

松科植物基因组总DNA提取方法的比较

目的:研究对比了用不同方法提取红松、樟子松和红皮云杉等3种松科植物叶片基因组DNA的效果,以寻找适合提取松科植物叶片基因组DNA的方法。方法:分别比较了用传统的CTAB法、SDS法以及3种改良的CTAB法提取的上述3种松科植物叶片基因组DNA的电泳、纯度和酶切效果。结果:采用不同方法提取的3种松科植物叶片基因组DNA的质量差异较大。结论:常规CTAB法和SDS法无法提取出高质量松科植物基因组DNA,而改良后的CTAB法的提取效果较好。     

DNA提取对微生物多样性测序分析的影响

运用高通量测序技术分析复杂样品中微生物种群的变化情况,已经成为目前微生物研究领域的热点问题之一。而微生物的样品准备,如DNA提取和16S可变区的扩增等,对于测序完成后的数据分析以及微生物原始群落组成的影响是至关重要的。采用国产试剂盒(天根土壤微生物基因组提取试剂盒)和进口试剂盒(MOBIO土壤微生物基因组提取试剂盒)分别对土壤样品和羊瘤胃食糜样品进行DNA提取。然后选取总DNA起始量为25ng,对16S V3可变区进行PCR扩增和文库构建,最后通过数据分析比较不同试剂盒提取的DNA对微生物多样性变化的影响,包括OTU数目、稀释曲线、微生物数量及物种种类等。研究发现,在相同DNA模板量和PCR条件下,进口试剂盒提取的DNA能够获得更多的微生物种类。     

富集培养及高质量DNA提取有利于从土壤宏基因组中获取新卤醇脱卤酶基因

目的:宏基因组技术作为一种不依赖于微生物纯培养的新方法,在挖掘新基因方面具有极大的潜力。本研究旨在建立一种从土壤中高效获取卤醇脱卤酶新基因的策略。方法:通过对现有DNA提取方法进行改进,同时结合富集培养途径以提高土壤宏基因组DNA质量和特异性;在此基础上,应用T-Coffee及CDEHOP程序设计特异引物并对目的基因进行扩增,同时采用正交法设计优化扩增条件,以提高获得卤醇脱卤酶基因的效率。结果:应用改进法提取的DNA质量较改进前有大幅度提高,其D260nm/D280nm及D260nm/D230nm值均大于1.8,且可以不经纯化直接用于PCR和相关酶切实验;PCR扩增目标基因的特异性增强,其中用经富集培养后所得DNA为模板扩增目标基因的特异性最强,TA克隆测序阳性结果比例最高。结论:富集培养和高质量DNA的获得有助于基于宏基因组途径获取新基因。     

一种改良的植物基因组DNA通用提取方法

高质量的基因组DNA是分子生物学研究的基础,而从富含糖类和次生代谢物且异质性强的植物材料中分离DNA相对困难。本方法在CTAB法和商业DNA提取试剂盒的基础上,在裂解细胞之前,对植物材料进行预处理．去除干扰DNA提取的代谢物,并在后续步骤中进行了一些优化。该方法适于多种不同的植物种类,所提取的基因组DNA质量较好,能满足下一步基因操作的要求,是一种通用的植物基因组DNA提取方法。     

血浆游离DNA全基因组甲基化测序的实用稳定性评估

随着液体活检技术的发展,血浆游离DNA成为当前的研究热点之一。血浆游离DNA的全基因组甲基化测序被认为在癌症检测等医学应用拥有巨大潜力,但目前尚缺乏针对该实验流程的实用稳定性评估。文中利用两名志愿者在不同时间采样的血浆游离DNA,在不同实验平台分别进行DNA甲基化的重亚硫酸盐转化前建库(Pre-BS)、转化后建库(Post-BS)和常规DNA建库,获取多因素影响下的测序数据样本。在此基础上,建立了一套血浆游离DNA测序数据分析的质量控制参考流程,综合评估了血液采集提取、游离DNA建库测序过程的实用稳定性,为血浆游离DNA全基因组甲基化测序应用于临床液体活检提供实用性的基础参考。     

一种快速提取细菌总DNA的方法研究

随着分子生物学技术应用于环境微生物研究的深入开展,占自然界微生物物种总数的90%以上的不能人工培养或培养困难的微生物已经可以借助分子生物学技术进行功能基因的开发和利用。而快速得到纯度较高,结构完整的细菌染色体DNA成为这一技术得以实现的前提。本文报道了利用高温处理和SDS的裂解作用相结合而建立的一种快速、简便的提取细菌染色体DNA的方法。经过脉冲电泳实验证明,利用本方法提取得到的几种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的基因组DNA结构完整,并且无明显降解,无须经过纯化,可以直接进行PCR扩增和酶切等分子生物学操作,将此方法进一步应用于土壤环境DNA的提取方面,同样达到了快速得到大片段、高质量的环境微生物基因组的目的,为研究未培养的环境微生物多样性打下了坚实的基础,同时为环境基因组的提取提供了一个新的途径。     

难提取细菌基因组DNA提取方法的比较与优化

目的:比较并优化2种试剂盒提取以巨型球菌为代表的难提取细菌基因组DNA的方法,以获得高质量的DNA用于高通量测序,探索高通量测序样品的前期处理方法。方法:用Life Technologies公司的Charge Switchg DNA Mini Bacteria Kit和Roche公司的High Pure PCR Template Preparation Kit提取制备困难的巨型球菌基因组DNA,然后通过添加溶葡球菌酶和增加溶菌酶、RNase A、Protein K的投入量及延长消化时间优化2个试剂盒,对4种方法提取的细菌基因组DNA进行浓度、纯度和基因组完整性测定,选取质量良好的基因组进行高通量测序。结果:改良后的2个试剂盒提取的巨型球菌DNA浓度较高,分别达到78.4和67.8 ng/μL,可满足高通量测序的需求,并获得基因组全序列。结论:改良后的2种方法是提取制备困难的巨型球菌基因组DNA更好的方法。     

线粒体基因组的高通量测序策略

综述了高通量测序技术在线粒体全基因组测序中的策略,利用该技术对线粒体全基因组进行序列测定的方法可以归纳为两种,一种是先对目标mt DNA进行富集,包括mt DNA的提取纯化,目标区域PCR扩增法以及特异性探针杂交富集法(可分为基于微阵列和基于PCR探针的杂交富集法),然后对富集出的线粒体DNA进行高通量测序;另一种是先从待测样本的基因组高通量数据中挖掘出线粒体基因组序列信息,之后利用诱饵序列或者近缘物种的线粒体全基因组参考序列,使用软件MITObim对其进行组装。此外,还给出了线粒体高通量测序的优化流程图和介绍了混合样品的线粒体高通量测序策略。     

环境DNA技术在地下生态学中的应用

地下生态过程是生态系统结构、功能和过程研究中最不确定的因素。由于技术和方法的限制,作为"黑箱"的地下生态系统已经成为限制生态学发展的瓶颈,也是未来生态学发展的主要方向。环境DNA技术,是指从土壤等环境样品中直接提取DNA片段,然后通过DNA测序技术来定性或定量化目标生物,以确定目标生物在生态系统中的分布及功能特征。环境DNA技术已成功用于地下生态过程的研究。目前,环境DNA技术在土壤微生物多样性及其功能方面的研究相对成熟,克服了土壤微生物研究中不能培养的问题,可以有效地分析土壤微生物的群落组成、多样性及空间分布,尤其是宏基因组学技术的发展,使得微生物生态功能方面的研究成为可能;而且,环境DNA技术已经在土壤动物生态学的研究中得到了初步应用,可快速分析土壤动物的多样性及其分布特征,更有效地鉴定出未知的或稀少的物种,鉴定土壤动物类群的幅度较宽;部分研究者通过提取分析土壤中DNA片段信息对生态系统植物多样性及植物分类进行了研究,其结果比传统的植物分类及物种多样性测定更精确,改变了以往对植物群落物种多样性模式的理解。同时,环境DNA技术克服传统根系研究方法中需要洗根、分根、只能测定单物种根系的局限,降低根系研究中细根区分的误差,并探索性地用于细根生物量的研究。主要综述了基于环境DNA技术的分子生物学方法在土壤微生物多样性及功能、土壤动物多样性、地下植物多样性及根系生态等地下生态过程研究中的应用进展。环境DNA技术对于以土壤微生物、土壤动物及地下植物根系为主体的地下生态学过程的研究具有革命性意义,并展现出良好的应用前景。可以预期,分子生物学技术与传统的生态学研究相结合将成为未来地下生态学研究的一个发展趋势。     

基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法学的建立

目的:大量研究证实线粒体DNA(mtDNA)突变与肿瘤发生及进展密切相关,但使用传统测序方法难以高通量、高精确度的检测mtDNA突变,为此本研究建立了基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法.方法:提取肝癌患者癌、癌旁组织以及外周血细胞总DNA,利用PCR技术对线粒体基因组进行富集并对PCR产物进行平末端、粘性末端连接或对PCR引物进行氨基修饰,构建mtDNA测序文库.经Illumina HiSeq 2000平台测序后利用生物信息学方法与人类mtDNA参考序列进行比对,并进行测序数据分析.结果:通过对不同质量基因组DNA进行评估后,发现三对引物法适用于大部分DNA样本的mtDNA富集.进一步我们发现PCR引物的氨基修饰可显著提高测序数据覆盖均一性,降低测序成本.结论:本研究利用新一代测序技术通过对线粒体DNA富集方法以及测序覆盖度均一性进行优化,建立了一套灵敏、特异、高通量的mtDNA突变检测策略,为mtDNA突变与疾病研究提供了新方法.     

麦冬基因组DNA提取方法研究

为了从富含多糖、多酚的顽拗植物麦冬中分离出高质量基因组DNA,分别建立了改良CTAB法和改良SDS法。通过使用核分离液和CTAB/NaCl溶液、提取液中加入0.35倍体积无水乙醇等最大限度地除去杂质。将两种方法提取的8种麦冬DNA与两种离心柱式试剂盒提取的DNA在纯度、产率等方面进行对比,并进行双酶切和SRAP分析。麦冬类植物SRAP反应体系的建立尚属首次。结果表明,改良CTAB法和改良SDS法均能从8种麦冬叶片中提取到高质量的基因组DNA,改良CTAB法提取纯度更高,提取幼叶DNA纯度可以与离心柱式试剂盒媲美,能够满足多种分子生物学试验要求。在后续试验中,用改良CTAB法从20多种沿阶草族植物中提取到了高纯度DNA。该方法通用性好,提取的DNA纯度高,对其他顽拗类植物基因组DNA的提取具有借鉴意义。     

长读长测序技术在宏基因组学研究中的应用

由于很多微生物无法单独分离培养,研究微生物群落整体的宏基因组学是目前揭示微生物多样性的重要方法。长读长测序技术可以覆盖重复序列和复杂结构,获得短读长无法检测的基因组信息。现着重介绍了两类长读长测序技术,即基于第三代测序技术的单分子长读长测序技术和基于片段相互联系的合成长读长测序技术,并进一步介绍了长读长测序技术在宏基因组学领域的应用。     

DNA提取过程中混入的实验室空气微生物DNA定量

元基因组测序方法为微生物研究提供了有力的工具。但其中的DNA提取过程,会不可避免地混入实验室中的空气微生物。这些微生物DNA,是否会对一些极微量的元基因组检测 (如皮肤样本等) 结果造成影响,有多大影响,仍没有明确结论。本研究首先收集了实验室空气样品,用16S rRNA引物建立了基于qPCR的标准曲线,并检测了在开放环境下提取DNA过程中可掺杂的环境微生物DNA量。然后在开放环境下提取纯水DNA样品并进行元基因组分析,以确定掺杂环境微生物的种类。最后分别在生物安全柜和实验室开放环境下提取皮肤样本,并用鸟枪测序方法对样本的微生物组成进行分析,以评估掺杂环境微生物对元基因组检测结果的影响。结果显示,在实验室开放环境的DNA提取过程中,环境微生物的DNA残留可达28.9 pg,可达某些极微量样本DNA总量的30%。元基因组分析显示,样品中掺杂的环境微生物主要是痤疮杆菌Cutibacterium acnes、大肠杆菌Escherichia coli等皮肤常见细菌。与洁净皮肤样本的信息相比,开放环境下提取掺杂了数十种环境微生物,并导致主要菌种的丰度大幅降低,从而影响结果的真实性。因此,微量样品的DNA提取应在洁净环境下执行。     

非损伤性取样样品中富集宿主DNA的研究进展

非损伤性取样被广泛应用在动物保护遗传学、分子生态学和分子进化等研究领域.随着基因组测序技术的发展和基因组学时代的到来,如何从非损伤性取样样品中获取能够用于进行基因组测序的高质量DNA是研究者面临的难题.本文总结和比较了非损伤性取样中最常用的粪便样品和考古材料或博物馆标本两类样品中富集宿主DNA的方法及应用,以期为非损伤...