PCR—SSCP检测肺癌细胞p53基因点突变

应用溴化乙锭（ＥＢ）染色的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术对１０例非小细胞性肺癌组织标本ｐ５３基因外显子５￣８进行分析,其中１例在外显子５￣６;１例在外显子７;２例在外显子８发现异常电泳带。对１例经ＳＳＣＰ检测异常的ｐ５３基因进行核酸序列分析,发现第２８０位密码子ＡＣＡ,其编码的氨基酸由丝氨酸变成半胱氨酸。结果证实：非小细胞性肺癌与ｐ５３基因突变有关;ＥＢ法ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术是一种简便、可靠的点突变检测法。     

PCR—单链构象多态性分析对p53基因点突变检测的研究进展

单链构象多态性（ＳＳＣＰ）对分析基因的突变是一种有效的手段,并具有其独特的优点。ＰＣＲ与ＳＳＣＰ结合后检测灵敏度更高,而在许多类型的肿瘤都存在有ｐ５３抑癌基因的突变,章综述了ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析技术检测ｐ５３基因突变的进展。     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

用PCR技术克隆细小病毒H－1部分非结构蛋白基因

应用ＰＣＲ技术定向克隆了细小病毒Ｈ－１的非结构蛋白（ＮＳ）部分基因片段。自行设计并合成了ＰＣＲ引物△Ｐ３和△Ｐ４,在两个引物中分别引入两个突变碱基,使扩增后的ＤＮＡ片段的两端含有限制性核酸内切酶ＨｉｎｄⅢ或ＢａｍＨＩ的酶切位点,经双酿切法把该ＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１１８质粒中。对插入片段的ＤＮＡ序列测定和分析结果证实该片段为Ｈ－１ＮＳ－１基因序列。以此重组质粒为探针,采用分子杂交的方法,分别测定了Ｈ－１及ＭＶＭＤＮＡ在细胞内的复制水平。这一基因的克隆为制备Ｈ－１的质量监测、Ｈ－１及ＭＶＭＮＳ－１蛋白抑瘤作用机理及其在肿瘤细胞及正常组织中的转录表达等研究奠定了基础。     

人胃癌细胞系中p53抑癌基因变异的检测及其序列分析

ｐ５３抑癌基因由于点突变,缺失或易位等方式而丧失活性是多种肿瘤发生发展的重要机理之一。本文应用聚合酶链式反应─—单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法,对四种人胃癌细胞系ＭＧＣ８０３,ＢＧＣ８２３,ＧＣ７９０１和ＰＡＭＣ－８２中ｐ５３基因的第５、６、７、８四个外显子进行检测,结果发现,ＰＡＭＣ－８２的第５和第８外显子,ＧＣ７９０１的第６外显子存在突变。ＰＣＲ－直接测序证明,它们分别在１７４位、２８０位、２０４位密码子发生缺失Ｇ,ＧＣ→ＣＧ,ＡＴ→ＣＧ转变,因而可使其编码的ｐ５３蛋白分别发生移码突变,Ａｒｇ→Ｔｈｒ,Ｇｌｕ→Ａｌａ,而丧失肿瘤抑制功能。实验结果表明,ｐ５３基因在胃癌发生发展过程中,尤其是较晚阶段具有重要作用。     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

人胃癌细胞系中P53抑癌基因变异的检测及其序列分析

Ｐ５３抑癌基因由于点突变,缺失或易位等方式而丧失活性是多种瘤发生发展的重要机理之一。本文应用聚合酶链式反应－－单链构锡多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法,对四种人胃癌细胞系ＭＧＣ８０３,ＢＧＣ８２３,ＧＣ７９０１和ＰＡＭＣ－８２中Ｐ５３基因的第５、６、７、８四个外显子进行检测,结果发现,ＰＡＭＣ－８２的第５第第８外显子,ＧＣ７９０１的第６外显子存在突变,ＰＣＲ－直接测序证明,它们分别在１７４位、２     

非同位素PCR-SSCP方法的初步临床应用

单链构象多态性检测法 (PCR-SSCP)是近年发展起来的一项检测人类基因组 突变的新技术。然而,在该技术中需要使用放射性同位素标记的核苷酸或引物,从而限制 了其广泛临床研究及诊断方面的应用。本文报告一种改进的PCR-SSCP方法, 该方法不用 同位素标记引物,而直接在溴乙啶染色的聚丙烯酰胺凝胶上显示SSCP。用该方法对55例 平滑肌肉瘤p53基因第7外显子突变的检测表明,38%的瘤组织DNA存在异常的SSCP。其中10例有HaeⅢ和MspⅠ酶切位点的突变(18%), 19例有突变型p53蛋白的过度表达(9例同时有异常SSCP改变)。而p53质粒D NA,平滑肌瘤及Alzheimer病患者基因组DNA无p53基因第7外显子扩增片段的异常SSCP改变。同时,还使用该方法对临床诊断的20例Alzheimer病患者和8例健康对照进行了β-淀粉样蛋白前体基因第16和17外显子的扩增及分析,均未发现有异常SSCP改变及EcoRⅠ,BclⅠ酶切位点的突变。本研究结果提示,该非同位素PCR-SSCP方法可靠、敏感、简便、快速,具有潜在的推广价值。     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的…

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ １到Ｓｅｇｍｅｎｔ １０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ     

DMBA、垂体移植诱发性乳腺瘤内172~（Arg－Leu）突变型p53的特性及其与基因重排和扩增关系的研究

ｐ５３最早发现于ＳＶ４０转化的细胞系,后来几乎在所有不同类型的细胞内均检测到这种蛋白质,野生型Ｐ５８是一种有效的肿瘤抑制因子,但突变体ｐ５２可与ｒａｓ－肿瘤基因协同转化体外的腺代细胞,而且在肿瘤发生时常伴随有ｐ５３基因的突变。乳腺癌内,ｐ５３基因的突变率为４０％,并可见到某些肿瘤基因参与癌症的形成过程,暗示ｐ５３基因结构和功能的改变可能与这些基因的重排和扩增有关。本实验选择４种不同年龄的１７２~（Ａｒｇ－Ｌｅｕ）突变型ｐ５３转基因小鼠为受试动物,将同系动物的垂体腺植入小鼠的肾脏后,再以致癌剂ＤＭＢＡ处理,以使动物乳腺内的ｐ５３基因表达和诱导小鼠乳腺癌形成。从乳腺癌小鼠分别摘取乳腺组织,提取ＤＮＡ和ＲＮＡ,以Ｈ－ｒａｓ、ＰＣＮＡ、ＣｙｌｉｎＤ１、ｐ５３基因的ＤＮＡ片段作为特异性核酸探针,进行ＳｏｕｔｈｅｒｍＢｌｏｔｔｉｎｇ和ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ分析,以检测在突变体Ｐ５３表达的情况下,ＰＣＮＡ、Ｈ－ｒａｓ、ＣｙｉｎＤ１等基因在体内的变化规律。实验发现,在４组不同的受试动物中,其乳腺癌细胞的ＰＣＮＡ和Ｈ－ｒａｓ两种基因发生了基因重排,特征是其ＤＮＡ标本中分别出现了一条很强的额外杂交带,但对照动物乳腺该类     

HBV─C基因探针的制备及应用

应用ＰＣＲ技术扩增出ＨＢＶＤＮＡＣ基因片段并与ｐＡＴ１５３质粒重组,转化到Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ中,经体内扩增,提纯,用光生物素标记,制备了Ｃ基因的重组质粒探针。该探针检测灵敏度在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹中达１ｐｇ,在点印迹中为５ｐｇ。用此探针以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方式配合ＰＣＲ技术检测乙肝病人血清中的ＨＢＶＤＮＡ,在５３例ＰＣＲ产物电泳检测阴性的样品中,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交又检出１８例阳性。     

日本血吸虫(中国大陆株)谷胱甘肽转移酶编码区基因的体外扩增、克隆及在原核细胞的高效表达

为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶（ＳｊＧＳＴ）基因工程重组蛋白,以日本血吸虫（中国大陆株）ｃＤＮＡ为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ编码基因序列,将扩增产物连接ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ中,转染大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达效果。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出日本血吸虫ＧＳＴ编码区基因片段,其     

HBV—C基因探针的制备及应用

应用ＰＣＲ技术扩增出ＨＢＶ ＤＮＡ Ｃ基因片段并与ｐＡＴ１５３质粒重组,转化到Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ中,经体内扩增,提纯,用光生物系标记,制备了Ｃ基因的重组质粒探针。该探检测灵敏度在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹中达１ｐｇ,在点印迹中为５ｐｇ。用此探针以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方式配合ＰＣＲ技术检测乙肝病人血清中的ＨＢＶ ＤＮＡ,在５３例ＰＣＲ产物电泳检测阴性的样品中,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交又检出１８例阳性。     

p53基因对人胃癌细胞系恶性生长的影响

以ｐ５３ｃＤＮＡ为探针,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法对人胃癌细胞系ＢＧＣ８２３进行了检测,发现该细胞中ｐ５３基因存在异常,将可在真核细胞表达的重组野生型Ｐ５３质粒ｐＣ５３－ＳＮ３和突变型ｐ５３质粒ｐＣ５３－ＳＣＸ３,用指质体介导法,分别导入ＢＣＧ８２３细胞,获得了较长时间受Ｇ４１８的多个阳性克隆。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ抑迹法证实阳性克隆细胞中有外源性ｐ５３基因存在。     

人促红细胞生成素基因组基因和cDNA的克隆及其在COS－7细胞中的表达

利用ＰＣＲ技术,从正常人胎肝染色体ＤＮＡ中克隆到长度为１５７２ｂｐ的人促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成１３ｂｐ外显子１的编码区,并与１５７２ｂｐ片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的ＥＰＯ基因插入载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ得到ｐＳＶ２－ＥＰＯ表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人ＥＰＯ单抗及兔抗人ＥＰＯ多抗,对表达产物进行ＥＬＩＳＡ定量测定,细胞分泌ＥＰＯ量高达２５１±７Ｕ／ｍｌ．Ｋｒｙｓｔａｌ法测得体外生物活性２４１．５±６．５Ｕ／ｍｌ．用ＥＰＯ单抗免疫沉淀结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了ＥＰＯ条带。从高效表达ＥＰＯ的转染细胞中分离纯化ｍＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆到ＥＰＯ的ｃＤＮＡ,这为ＥＰＯ在其它系统中的表达及ＥＰＯ的功能与结构的研究打下了基础。     

伪狂犬病毒蛋白激酶基因的PCR扩增及其克隆鉴定

以ＢＨＫ－２１细胞单层上增殖的伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）,经离心浓缩后,用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ消化法分离纯化ＰＲＶ基因组ＤＮＡ。参照ＰＲＶＫａ株和ＮＩＡ－３株蛋白激酶（ＰＫ）基因的ＤＮＡ序列,设计并合成了一对长度为２６ｂｐ和３２ｂｐ的引物,以纯化的ＰＲＶ基因组ＤＮＡ为模板,用ＰＣＲ技术成功地扩增出我国伪狂犬病毒地方株的ＰＫ基因,并将它克隆于ｐＵＣ１９载体。酶切分析结果表明,所获ＰＫ基因克隆在ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ和ＳａｌＩ上的切点与ＰＲＶＮＩＡ－３株相同。为下一步进行ＰＫ基因的体外缺失和重组,以构建减毒的ＰＫ缺失疫苗株奠定了基础。     

中国人雄激素受体N端转示激活区的测序及突变检测

雄激素受体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＡＲ）Ｎ端转录激活功能区（ＡＦ１）是ＡＲ发挥转录激活所必需的。用４对引物（Ａ３－Ａ４）ＰＣＲ扩增２０例中国正常男性ＡＲ的ＡＦ１,双链ＤＮＡ循环测序以确定正常中国人ＡＲ的ＡＦ１的核苷酸顺序。在此基础上,用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析和双链ＤＮＡ循环测序法对２例雄激素抵抗征（ＡＩＳ）患者外周血白细胞和１５例前列腺癌（ＰＣ）患者癌组织中ＡＲ的ＡＦ１区进行突变检测。     

甜菜多粘菌基因组片段的克隆及PCR检测

根据资料报导设计引物,扩增Ｐｏｌｙｍｙｘａ　ｂｅｔａｅ的基因组片段,将其克隆在ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）质粒载体上,并通过双酶切、ＰＣＲ扩增和部分序列测定,证明克隆片段为Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段。用扩增Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段的引物对由Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ侵染小麦和Ｏ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ侵染豇豆根系抽提的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增,均未获得任何ＤＮＡ产物,进一步证实了上述结果。对移入病土２、３．５天的甜菜苗单株根系进行ＤＮＡ粗提,移入病土３．５天的甜菜苗ＰＣＲ检测其已被Ｐ．ｂｅｔａｅ侵染,对确定Ｐ．ｂｅｔａｅ的早期侵染有重要意义。     

棒状杆菌2,5—二酮基—D—葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆？…

从棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＳＣＢ３０５８）初步纯化得到两个２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸（２,５－ＤＫＧ）还原酶,在此基础上利用ＰＣＲ技术,以基因组ＤＮＡ为模板,扩增得到含有２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到ＰＧＥＭ３Ｚｆ（＋并转化大肠杆菌ＤＨ５α,是到阳性克隆ｐＧＥＭ８１３。     

丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究

用ＰＣＲ 方法从丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） ｃＤＮＡ 文库中克隆了两段ＤＮＡ 片段,即ＨＣＶ 基因组非结构ＮＳ３区抗原基因（约０．７ ｋｂ）和核心抗原Ｃ区抗原基因（约０．６ ｋｂ）的ｃＤＮＡ 片段。在两段ｃＤＮＡ 间加入连接肽Ｓｅｒ－ Ｐｒｏ－ Ｇｌｙ－ Ｓｅｒ 的密码子序列,构建成融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ。将该融合基因与衣藻叶绿体基因ａｔｐＡ 的启动子和ｒｂｃＬ 基因的３′末端连接,得到丙肝病毒融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ表达盒,再将该表达盒与选择标记基因ａａｄＡ 表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接,构建成衣藻叶绿体转化载体ｐＳＳ６。基因枪法转化衣藻叶绿体,经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落,对转基因衣藻的ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析表明,融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ已整合到衣藻叶绿体基因组中。