甘蔗几丁质酶基因的电子克隆与生物信息学分析

用电子克隆方法获得甘蔗几丁质酶基因SCCHI1,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:SCCHI1基因全长1236bp,包含一个完整的990bp的ORF,编码329个氨基酸。SCCHI1基因属于糖苷水解酶19家族,含有N-端信号肽、交连区、催化区,与高粱等其它植物的几丁质酶基因具有高度的相似性。为SCCHI1基因的分子克隆、功能鉴定和应用提供参考。     

甘蔗细胞色素P450还原酶基因的电子克隆与分析

旨在为甘蔗细胞色素P450还原酶基因的实验克隆、功能鉴定及其应用提供参考。本研究以甘蔗类似细胞色素P450还原酶基因的EST序列CF576130.1为探针,在甘蔗EST数据库中进行检索,并基于电子克隆技术获得了甘蔗细胞色素P450还原酶基因（Cytochrome P450 reductase）的一条cDNA全长序列,命名为ScCYP450。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、疏水性/亲水性、高级结构及功能域等方面进行预测和分析。结果表明该基因全长1 821 bp,包含一个744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸,该基因编码蛋白定位于细胞内质网（膜）,为可溶性碱性蛋白,不存在信号肽,二级结构原件多为无规卷曲,含有多个保守功能域,主要功能为辅酶因子生物合成和翻译功能。     

葡萄乙醇脱氢酶基因Ⅲ的电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆方法获得葡萄乙醇脱氢酶基因Ⅲ(ADHⅢ),并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析.结果表明,葡萄ADHⅢ基因全长1 602 bp,包含1 140 bp的ORF,编码379个氨基酸,该蛋白不具有明显的疏水区域,也无跨膜结构域,α-螺旋和不规则卷曲是其二级结构的主要构件.葡萄ADHⅢ包含有ADH功能域,和其他植物的ADHⅢ在序列组成、高级结构及活性位点等方面均具有高度的相似性.     

甘蔗天冬氨酰半醛脱氢酶基因的电子克隆与分析

应用电子克隆技术,以水稻EF576477序列为探针,获得了甘蔗天冬氨酰半醛脱氢酶基因（aspartate．semialdehydedehy—drogenase,ASADH）的一条cDNA全长序列,命名为ScASADH。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、疏水性／亲水性、高级结构及功能域等方面进行预测和分析。结果表明：该基因全长1711bp,包含一个1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸,该基因编码蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,存在信号肽,二级结构原件多为无规卷曲,含有多个保守功能域,主要功能为翻译。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗根尖、幼苗、花序、叶片和茎中组成型表达,其中在茎中的表达量比其他组织类型中表达量高。该基因的表达受葡萄糖杆菌和赤腐病菌的调控。     

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。     

糜子抗旱节水相关基因PmMYB的克隆及表达分析

根据在糜子抗旱节水分子基础研究中获得的一个糜子MYB基因的EST序列, 以其序列及水稻MYB18基因的序列为基础设计引物, 扩增得到1 739 bp的全长基因组序列。序列分析表明, 其包含121 bp(347~467 bp)和93 bp(599~691 bp)的两个内含子, 3个外显子; 全长cDNA序列为1 525 bp, 其中3′非翻译区为212 bp, 5′非翻译区为41 bp, 编码区为1 272 bp, 共编码424个氨基酸, C-端存在一个丝氨酸(Ser, S)丰富区。该基因具有两个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区(DNA-binding domain), 分别为13~63、66~114位氨基酸, 属于典型的R2R3-MYB转录因子。对其与水稻、玉米、火炬松、拟南芥、辣椒、陆地棉、大麦及茄子等9种植物的MYB基因的R2、R3重复区的氨基酸序列多重比较, 表明R2R3重复序列在植物中具有较高的保守性; 基于氨基酸序列的编码区系统进化树分析表明, 不同植物的MYB基因遗传分化很大, 序列相似性为32%~84%, 其中糜子MYB基因与水稻的MYB18相似程度最高(84%), 与大麦和玉米的相似性分别为46%和41%。通过半定量RT-PCR对其表达模式分析表明, 该基因在水分胁迫和干旱后复水条件下上调表达, 与糜子抗旱节水紧密相关。该基因的克隆为进一步探讨利用该基因改良其他植物的抗旱节水性奠定了良好的基础。     

橡胶草异戊烯焦磷酸异构酶基因的电子克隆及分析

利用电子克隆方法获得两条橡胶草异戊烯焦磷酸异构酶基因（IDI）的eDNA序列和编码区基因组序列,分别命名为TkIDI1和TklDl2,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行系统进化、亚细胞定位、活性位点、高级结构等方面的预测和分析。结果显示,TklDI1的eDNA序列长度为980bp,包含一个696bp的开放读码框（ORF）,编码232个氨基酸,预测定位于内质网或叶绿体上;TkIDl2的eDNA序列长度为1038bp,包含一个843bp的ORF,编码281个氨基酸,预测定位于线粒体或叶绿体;而他们的截短转录本蛋白定位于胞质中,且都具有过氧化物酶体定位信号。结构分析表明TkIDI1和TkIDI2与植物IDI蛋白同源,活性位点保守,高级结构与其他植物的IDI均具有高度的相似性。     

红麻MYB21基因的克隆、表达及载体构建

克隆红麻不育系和保持系的MYB21基因,分析MYB21基因在红麻不育系和保持系各器官的表达量,并构建过表达载体和RNAi载体,旨在为进一步研究该基因在红麻中的功能奠定基础。以同源克隆的方法克隆MYB21基因;用实时荧光定量的方法分析MYB21基因在红麻不育系和保持系不同组织器官的表达模式;根据酶切-连接的方法,构建过表达载体和RNAi载体。结果显示,红麻MYB21基因在不育系和保持中的基因序列没有差异,其c DNA全长序列为922 bp,包含843 bp的开放阅读框,DNA全长序列为1 108 bp,包含3个外显子和2个内含子(NCBI序列登录号为KT898146);MYB21基因主要在花药中表达,在不育系和保持系花药之间表达量呈极显著差异;成功构建MYB21过表达载体和RNAi载体。成功克隆MYB21基因的全长序列;实时荧光定量结果表明MYB21基因主要在花药中进行表达;构建的植物过表达载体PBI121-MYB21和RNAi载体p ART27-PK-R1-F2可用于该基因的功能研究。     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶（ACC）基因的克隆及CT功能域基因的原核表达

利用简并PCR结合染色体步移法首次克隆获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶（ACC）基因的全长序列信息。序列分析表明,该基因包含2个内含子,分别位于42～147 bp和315～677 bp处,编码区域总长为6 801bp,推导的氨基酸序列进行二级结构分析具备乙酰辅酶A羧化酶典型的3个功能域：生物素羧化酶（BC）、生物素羧基载体蛋白（BCCP）和羧基转移酶（CT）。克隆该基因的CT功能域基因,连接到原核表达载体pET-28a上,在Escherichia coli BL21（DE3）中成功表达,利用Ni-NTA树脂柱纯化获得CT的可溶性重组蛋白,浓度为1.8mg/mL,为研究ACC的功能和针对CT作用的除草剂机理研究提供了有价值的材料。     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

巴西橡胶树HbMYB62转录因子基因的克隆和表达分析

R2R3-MYB类转录因子参与包括逆境胁迫反应等多种生物反应。为鉴定橡胶树中MYB转录因子的结构与功能,从橡胶树叶片中克隆HbMYB62全长的cDNA序列。该基因片段大小为1 013 bp,包含945 bp的ORF,编码314个氨基酸残基。其推导的氨基酸序列具有植物HTH_MYB的特异性结构域,并与拟南芥AtMYB62具有高度相似性。qRT-PCR发现HbMYB62主要在橡胶树花中表达,而在树皮、叶和乳胶中表达量较少。其叶片表达量在过氧化氢（H₂O₂）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）等处理下显著上调。表明HbMYB62与橡胶树的抗逆反应和激素信号传导过程有关,为进一步研究其结构和功能打下基础。