人GDNF基因在昆虫细胞中的高效表达

应用昆虫杆状病毒表达系统在昆虫细胞Ｔｎ－５Ｂ１－４中高效表达了人胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）,ＰＡＧＥ分析表达量占细胞可溶性蛋白质的３０％左右,表达产物经亲和层析纯化后纯度达８０％以上,活性研究表明,昆虫细胞表达的ＧＤＮＦ蛋白能显著促进多巴胺能神经元的存活,此研究为进一步研究ＧＤＮＦ结构与功能打下了良好的基础。     

重组人可溶性CD14在昆虫细胞表达系统中的表达

BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统.将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中,重组质粒转化DH10BAC感受态细胞,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中,后者转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒.利用重组蛋白C-末端的6×His@Tag,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清--步纯化得到重组蛋白,计算表明从1L培养基中可纯化到约8mg纯度大于95%的重组sCD14蛋白,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性.疑胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合,并能增强LPS诱导THP-1细胞产生细胞毒性因子.     

水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8在昆虫细胞中的表达

将水稻矮缩病毒 (RiceDwarfVirus,RDV)外壳蛋白基因S8克隆到杆状菌毒转移载体 pVL1 393中 ,重组转移载体 pVL1 393 S8与线性杆状病毒RP2 3.LacZ共转染草地夜蛾细胞sf9,经过细胞体内同源重组、PCR筛选得到重组病毒RP2 3 S8。重组病毒RP2 3 S8感染sf9细胞后 ,收集细胞 ,并进行SDS PAGE及Western blot检测。结果表明 ,S8基因在昆虫细胞中成功表达 ,且在感染后 96h表达量最高     

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此,系统了解这些复合体的生物学功能,将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点,因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体,为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。     

昆虫杆状病毒表达载体系统与疫苗研制的30年回顾

1983年12月,一篇关于用昆虫杆状病毒感染昆虫细胞表达重组人β干扰素文章的发表,标示了杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)的诞生。迄今为止,已采用BEVS表达生产了数千种重组蛋白,其中7种已被成功用于商品化人用或兽用疫苗的抗原。仅对30年来基于BEVS的疫苗研制作一论述。     

昆虫杆状病毒表达系统研究进展

本文概括了昆虫杆状病毒的生物学、基因组结构和调控方面取得的进展,并对该载体系统的构建及外源基因的表达等研究作了评述。     

昆虫细胞—杆状病毒表达系统表达尿激酶原

在转瓶和２Ｌ搅拌反应器中,利用重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ感染ｓｆ９昆虫细胞表达尿激酶原。在转瓶中,细胞接毒密度１２×１０６／ｍＬ、ＭＯＩ＝３０时,尿激酶原活性达到１０６５ＩＵ／ｍＬ。研究了尿激酶原表达过程中葡萄糖、乳酸的代谢变化。实验结果表明细胞状态对尿激酶原的表达水平有显著影响。     

人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达

人尿激酶原是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性,为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达ｐｒｏ－ＵＫ,我们在ｐＡｃ３７３基础上,插入野生型ＡｃＭＮＰＶ ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ启动子区－７～－１碱基序列,构建了一个高表达转移载体ｐＡｃＹＴ．分别经三次克隆将ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ正向插入到转移载体ｐＡｃ３７３或ｐＡｃＹＴ的ＢａｍＨＩ－ＫｐｎＩ位点上。用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将ｐＡｃＹＴ－ＵＫＤＮ     

汉滩病毒M、S基因不同拼接方式在昆虫细胞中融合表达效果比较

将汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)部分片段以不同方式拼 接,构建G1S0.7或S0.7G1嵌合基因,分别插入杆状病毒表达载体pFBD,转化DH10Bac致敏菌, 获得含有嵌合基因的重组穿梭质粒Bacmid,用其转染Sf9细胞,快速筛选出含有G1S0.7或S0.7 G1嵌合 基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达外源融合蛋白.利用间接免疫荧光、ELISA和免疫 印迹对表达产物进行检测.结果表明,含G1S0.7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表 达出融合蛋白,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别,其分子量约97 kD;含S0.7G1嵌合基因之重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的融合蛋白,只能被抗汉滩病毒核 蛋白特异性单抗所识别,其分子量约43kD.上述结果提示,G1S0.7嵌合基因可能在昆虫细胞 中表达出完整的具有生物学活性的融合蛋白,S0.7G1嵌和基因的昆虫细胞表达产物不完整 ,且生物学活性不如G1S0.7嵌合基因的表达产物.     

大鼠卵巢促黄体激素受体膜外微区(1-341)在昆虫细胞中的表达及其性质的初步研究

促黄体激素/人绒毛膜促性腺激素受体(LH/hCG receptor)N端膜外微区341个氨基酸残基(简称R341)与激素有很高的亲和力。本文报道编码R341的cDNA在昆虫细胞中的表达及其产物性质的初步研究。SDS-PAGE银染和免疫印迹结果显示,表达产物呈两条带:分子量为38.5Kd的主带和分子量为40.0Kd的次带。配基结合免疫印迹和~(125)IhCG结合印迹分析表明,表达产物R341具有与配基专一性结合的生物活力。竞争性配基结合曲线和Scatchard分析结果显示,重组受体R341和配基hCG有较高的亲和力,与hCG反应的Kd为5.68×10~(-10)mol/L。     

大鼠卵巢促黄体激素/人绒毛膜促性腺激素受体cDNA的克隆和在昆虫细胞中的高效表达

促黄体激素/人绒毛膜促性腺激素受体(LH/hCG receptor)是一种与G-蛋白偶联的糖蛋白。本文报道了从大鼠卵巢cDNA库中筛选LH/hCG受体cDNA及其在昆虫细胞中的高效表达。LH/hCG受体cDNA全长2403bp,编码受体信号肽和成熟受体674个氨基酸。用多角体病毒表达载体pVL1393,LH/hCG受体cDNA在昆虫细胞中得到高效表达。在非还原和还原条件下的SDS-PAGE分析显示,用亲和层析分离纯化的受体表观分子量分别为120Kd和92Kd。经配基结合和Scatchard Plot分析表明,其与hCG反应的Kd为8.4×10~(-9)mol/L,与CHO细胞表达产物相似。     

鼠白细胞介素12(mIL-12)在昆虫细胞中的表达

人IL-12的作用具有种属特异性,无法对鼠淋巴细胞起作用。因此,为了在啮齿动物模型上研究该细胞因子的免疫学效应,并评价其临床应用前景,就很有必要获得重组鼠IL-12(mIL-12)。为此,我们首先构建了两个表达载体pVL1393-mp40和pVL1393-mp35,并分别与线性化多角体病毒基因组DNA共转染昆虫细胞株Sf9,用目视法筛选出重组病毒AcNPV-mp40和AcNPV-mp35,然后共感染昆虫细胞,使mp40和mp35在昆虫细胞中共表达。经实时BIA和Northern blot分析,表明重组mIL-12在昆虫细胞中表达成功。经还原条件下的SDS-PAGE分析,重组mp40和mp35的分子量分别为40KDa和22KDa。非还原条件下的Western blot结果显示,重组mIL-12的表观分子量为80KDa。用抗体捕获法在条件培液中测到了重组产物的生物活性,经与参照标准相比照,重组mIL-12的表达量约为10-15μg/10~6细胞。     

重组含有Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)基因的杆状病毒在昆虫细胞中的表达

用杆状病毒表达系统重组病毒,在昆虫细胞中表达了完整的含有ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因３个外显子开放读码框架的长２．３ｋｂ的ｃＤＮＡ片段。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞,用免疫荧光染色,结果表明：４８小时表达重组蛋白,７２小时细胞较完整,免疫荧光染色强阳性,９６小时后细胞出现破碎。我们采集７２小时的组织培养上清和细胞破碎裂解液,分别采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ分子筛法,用免疫蛋白印迹法实验证明,表达的蛋白能被抗ＬＭＰ１的单克隆抗体所识别,测定表达蛋白的分子量为６０ｋＤ。经蛋白含量扫描图分析,采用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－７５柱初步纯化表达的ＬＭＰ１蛋白,将后者进行裸鼠体内致瘤实验,未见肿瘤生长。     

中国株丙型肝炎病毒（HCV）结构区蛋白在昆虫细胞中的表达及加工

利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了完整的中国河北株丙丙型肝炎病毒结构蛋白。免疫印迹实验结果显示,表达产物中有一系列分子量不同、可以与ＨＣＶ抗体阳性病人血清反应的蛋白,表明结构蛋白被宿主细胞蛋白酶切割与加工,相应分别为２０ｋＤ的核心蛋白、３２ｋＤ糖基化的Ｅ１蛋白４０ｋＤ的未糖化的Ｅ２蛋白和７０ｋＤ糖基化的Ｅ２蛋白,另有８０ｋＤ及１００ｋＤ的两组前体蛋白。利用表达产物检测慢性ＨＣＶ感染者血清,发现     

在昆虫细胞中表达G2型轮状病毒地方株VP7基因

Ａ组轮状病毒是导致婴幼儿重症腹泻的最主要病毒病原,ＶＰ７是病毒外壳上的主要糖蛋白,它具有中和抗原活性,与病毒的毒力及免疫保护性有关,也是划分病毒血清型的最主要标志之一〔１〕。ＶＰ７基因及其编码蛋白一直是人们研究的主要对象,很多研究工作和诊断试剂都需大...     

HIV—1核蛋白p24在昆虫细胞中的表达

将完整的ＨＩＶ－１ ｐ２４基因克隆到杆状病毒转移质粒中,使用重组转移质粒与野生型杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经筛选获得带有编码ｐ２４基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中表达了ＨＩＶ核蛋白ｐ２４。其重组蛋白的分子量为２４ｋＤ。此重组糖蛋白在免疫荧光,免疫印染和酶联免疫实验中都能被人ＨＩＶ－１阳性血清和单克隆抗体所识别。     

昆虫细胞中存在角蛋白纤维

本文采用细胞分级抽提结合整装细胞电镜制样技术,分别在两种昆虫细胞:斜纹夜蛾(SL)细胞;甜菜夜蛾(SE)细胞中显示了一个精细的中等纤维网络结构,纤维自胞核发出,排列错综复杂,其单丝清晰可见,直径约为8～10nm;间接免疫荧光染色结果表明角蛋白抗体在两种细胞中均能显示出清晰的荧光纤维网络,而且荧光纤维的分布有所不同;用角蛋白抗体对这两种细胞全蛋白进行免疫印迹实验,均可显示49KD,68KD的两个主要多肽条带,说明这两种昆虫细胞中等纤维的主要成分为角蛋白.     

重组人卵泡刺激素在昆虫细胞中的表达

为了研究在昆虫细胞中表达重组人卵泡刺激素,我们以人胎盘组织提取的染色体DNA为模板,利用重叠PCR方法扩增出hFSHβ亚基的cDNA的编码区。将此cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表达载体pVL1393,我们得到了表达载体pVL1393-hFSHβ,然后与BaculoGold~(TM)线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞SF9,经多次扩增后获得高滴度的重组病毒AcNPV-hFSHβ。将此重组病毒感染昆虫细胞,我们得到了在胞浆中表达的hFSHβ亚基,Western blot显示分子量大约为21kDa。以重组病毒AcNPV-hFSHβ与AcNPV-hCGα一同感染昆虫细胞得到了具有分泌性的重组hFSH异二聚体,在非还原的条件下Western blot显示分子量大约为33kDa。     

绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞中的克隆与表达

将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到转移载体pVLneo的多角体蛋白基因(ocu)启动子下游,与杆状病素AcNPV DNA共转染昆虫细胞,通过同源重组和G418筛选,构建了整合有GFP基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的GFP,MW为30kDa,在荧光显微镜下呈现美丽的绿色,荧光光谱表明其激发波长395nm,发射波长509nm。Southern blot杂交证明,重组病毒的1kb EcoRI片段与GFP cDNA探针有很强的杂交信号,这是GFP基因在杆状病毒基因组中整合的直接证据。