大肠杆菌中表达关键基因产异丁醇的研究

目的:改造大肠杆菌的代谢途径,使非生产菌株大肠杆菌具备产异丁醇的能力.方法:将乳脂乳球菌NIZO B1157的2-酮酸脱羧酶基因kdcA克隆到大肠杆菌中,使大肠杆菌产异丁醇;另外,采取两种方法过量表达alsS、ilvC、ilvD基因,增加前体物质酮酸的供应,以提高异丁醇的产量:一是与kdcA串联表达;二是在另一个相容质粒中表达.结果:大肠杆菌工程菌具备产异丁醇的能力,其中相关基因在一个质粒中串联表达的产量比其在两个相容质粒中共表达的产量高30倍,达到3g/L.结论:导入的酮酸合成途径与醇类生产途径结合,能使非生产菌株大肠杆菌生产异丁醇,并且单质粒表达代谢途径相关基因的效果优于双质粒表达.     

天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。     

产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。     

右旋糖酐蔗糖酶工程菌株的构建及其培养条件的研究

[目的]右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶.[方法]利用PCR扩增技术,将已获得的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG亚克隆到表达载体PET28a( )上,转化E.coli BL21(DE3),经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后,得到右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG.[结果]经IPTG诱导该基因在E.coli BL21(DE3)中能有效表达,在诱导过程中菌体生长受到抑制.通过对培养时间、IPTG浓度、培养温度、菌浓(OD600)和pH值等产酶因素的优化考察,得到最佳培养条件为:培养时间5h、IPTG浓度0.5mmol/L、25℃、OD600值1.0和pH6.0.酶活力由最初的5.39U/mL提高到35.62U/mL,其中pH值对产酶活力影响最大,在pH6.0时的最高产酶活力是LB原始pH条件下最高酶活的3.5倍,并且pH值也是导致在诱导后期酶活迅速下降的主要原因之一.[结论]酶的表达和酶活的研究结果表明,构建的工程菌株能够异源高效表达右旋糖酐蔗糖酶,并且表现出较高的酶活力.     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

对羟基扁桃酸合酶基因的克隆表达及催化特性

【目的】比较两种不同来源基因重组的对羟基扁桃酸合酶(HmaS),考察其在大肠杆菌中的表达效率。【方法】分别对东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)来源的hmas进行异源表达,经离子交换层析和凝胶过滤色谱分离纯化获得HmaS,并检测HmaS的酶活和催化特性。【结果】来源于S.coelicolor的HmaSSC2比酶活是来源于A.orientalis的3.6倍;来源于A.orientalis的HmaSAO最适反应温度为28°C,在弱碱性条件下的酶活稳定性较好;来源于S.coelicolor的HmaSSC2最适反应温度为35°C,在28-45°C内保持较高的酶活,具有良好耐热性,在pH 7.0左右酶活最高,更易在偏中性的条件下发挥功能。【结论】HmaSSC2更适用于代谢工程改造大肠杆菌发酵法生产扁桃酸。     

Expression of Humicola insolens (NC3) endo-β-glucanase Ⅱgene in Pichia pastoris and anylysis of enzymic properties

[目的]在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究.[方法]利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ的cDNA.将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115.[结果]SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达.重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70℃,且在65℃以下具有较好的热稳定性.最适反应pH为6.5,在pH 6.0-7.0之间有较好的稳定性.[结论]用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础.     

利用重组大肠杆菌生产双乙酰

大肠杆菌自身代谢特征具有发酵生产双乙酰的天然优势。利用PCR技术,以广泛用于双乙酰生产的Lactococcus lactis基因组DNA为模板,克隆得到α-乙酰乳酸合成酶基因α-als,将其构建在表达载体pET-30 a上。与能够高效表达3种大肠杆菌来源HSP 70家族分子伴侣的pKJE 7质粒共同转化E.coli BL21(DE3)。利用目的蛋白质分子伴侣共表达的方法,首次获得了能够高效表达具有酶活力的α-乙酰乳酸合成酶的重组大肠杆菌。在静置培养条件下,能够在该菌株的培养基中检测到双乙酰的生成。融合蛋白酶在温度为30-40℃和pH在6-7之间时具有较高的酶活,以丙酮酸为底物,该酶最适pH为6.8,最适温度为39℃。     

芽胞杆菌(Bacillus sp.)YX-1耐有机溶剂葡萄糖脱氢酶的基因克隆与酶学性质

[目的] 从芽胞杆菌(Bacillus sp.)YX-1基因组中克隆出一种有机溶剂耐受型的葡萄糖脱氢酶基因,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,研究了重组蛋白的酶学性质.[方法] 依据芽胞杆菌属中葡萄糖脱氢酶氨基酸序列的保守性,设计合理引物,钓取来源于Bacillus sp.YX-1的葡萄糖脱氢酶基因,构建诱导型表达载体pET28a-gdh,于大肠杆菌中进行表达.镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,考察了重组蛋白的酶学性质.[结果] 葡萄糖脱氢酶基因全长为786 bp,编码261个氨基酸.酶学研究结果表明:该酶最适反应温度为45℃,最适pH值为8.0;具有良好的有机溶剂耐受性,于50％的辛烷、环己烷、癸烷中室温放置1h后,酶活仍能保持90％以上;具有较宽的底物谱,对多种糖均具有一定的催化活性,其中催化D-葡萄糖的活力最高,产生还原型辅酶因子;对辅酶NADH和NADPH具有相似的依赖性,对NAD+和NADP+的催化比活分别为8.37 U/mg和8.62 U/mg.[结论]利用生物信息学成功地挖掘出Bacillus sp.YX-1一种耐有机溶剂的葡萄糖脱氢酶,为氧化还原酶在有机相反应中的的辅酶再生循环提供了新型的生物催化剂.     

长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶在大肠杆菌中的活性表达与分泌调控

[目的]从长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)JNB-1中克隆出普鲁兰酶基因并在大肠杆菌系统中表达,通过优化诱导条件和使用化学添加剂提高了胞外酶活.[方法]采用PCR方法,从B.naganoensis基因组中扩增出普鲁兰酶基因pul,构建重组菌E,coli BL21/pET-20b-pul.通过优化,确定优化后的IPTG诱导条件以及甘氨酸、Na+的最佳添加参数.[结果]普鲁兰酶在大肠杆菌中得到有效表达,其相对分子质量为ll9kDa.在优化后的诱导条件(诱导温度20℃,IPTG终浓度0.4 mmol/L,在菌体OD600至1.2时诱导)下,普鲁兰酶的总酶活达到10.8 U/mL.添加甘氨酸和Na+均能有效促进普鲁兰酶的分泌.在诱导时添加终浓度0.08 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L Na+,胞外酶活提高至8.1 U/mL,是不加任何添加剂的10.3倍.[结论]该重组菌的构建为普鲁兰酶制剂的工业生产提供了有价值的菌株,对化学添加剂促进分泌的研究也为重组酶的高水平胞外生产提供了有效的方法.     

大肠杆菌ptsG和ptsM突变体的构建及特性研究

目的：敲除大肠杆菌DH5α中与葡萄糖磷酸化转运相关的ptsG、ptsM基因,考察缺陷株生长特性及其可能的应用。方法：PCR扩增靶基因,构建两翼带有靶基因序列并嵌合抗药基因标记的线性片段,利用Red同源重组技术敲除靶基因。结果：成功敲除了大肠杆菌DH5α的ptsG和ptsM基因;在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αΔptsG最高菌密度是亲本的2.8倍,添加吡咯喹啉醌或导入其生物合成基因后能够产酸;DH5αΔptsM最高菌密度是亲本的4/10,有明显的产酸现象。结论：DH5αΔptsG可用于大肠杆菌高密度发酵和吡咯喹啉醌生物合成基因缺陷株筛选。     

海藻酸钠/壳聚糖微胶囊固定化大肠杆菌的研究

本文以大肠杆菌ＤＨ5α为模型体系 ,探索了大肠杆菌ＤＨ5α用海藻酸钠 壳聚糖 (ＡＣＡ)微胶囊培养的可行性 ,并观察了微囊化大肠杆菌ＤＨ5α细胞生长与物料渗透性能 ,通过将ＡＣＡ微胶囊移植到实验组小鼠体内 ,考察了ＡＣＡ微胶囊作为口服药物载体的可能性。1　材料和方法1.1　材料壳聚糖 ,本实验室改性所得 ;海藻酸钠 ,ＫｅｌｃｏＤｉｖｏｆＭｅｒ ｃｋＣｏ .Ｉｎｃ .ＵＳＡ ;其它试剂均为国产分析纯。大肠杆菌ＤＨ5α ,长春生物制品所 ;ＬＢ培养基 ,华美生物制品公司提供。昆明系小白鼠 18～ 2 0ｇ ,解放军大连高等医学专科学校实验动物中…     

丁醇合成途径关键酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

【目的】克隆丙酮丁醇梭状芽胞杆菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824丁醇合成途径关键酶基因,构建产丁醇的工程大肠杆菌。【方法】以C.acetobutylicum ATCC824基因组为模板,分别扩增丁醇合成途径关键酶基因thil,adhE2和BCS operon(crt-bcd-etfB-etfA-hbd)基因序列,构建BCS operon-adhE2-thil/pTrc99a/MG1655(pBAT)。重组菌E.coli pBAT采用0.1 mmol异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5 h,测定乙酰基转移酶(THL)、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(HBD)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(CRT)、丁酰辅酶A脱氢酶(BCD)、醛醇脱氢酶(BYDH/BDH)的酶活。并以该基因工程菌作为发酵菌种,采用好氧、厌氧和微好氧三种培养方式,检测丁醇产量。【结果】酶活测定结果显示:THL酶活达到0.160 U/mg protein,酶活力提高了近30倍;HBD酶活力提高了近5倍;CRT酶活达到1.53 U/mg protein,野生菌株无此酶活;BCD酶活力提高了32倍;BYDH/BDH酶活力无显著提高。3种发酵培养结果显示在微好氧和厌氧条件下,均有丁醇产生,且丁醇的最大产量约为84 mg/L。【结论】本实验通过构建产丁醇基因工程大肠杆菌,实现了丁醇关键酶基因在大肠杆菌中的活性表达以及发酵产丁醇,为发酵法生产丁醇开辟了一条新的途径。     

基于重组技术的低毒力高效大肠杆菌原核表达系统的改造与应用

[背景]大肠杆菌作为原核表达系统常用宿主菌株,具有培养成本低、周期短和操作性强等优势,但同时也存在着一些不足.[目的]降低大肠杆菌内毒素合成水平及毒力,同时提高其可溶性表达外源蛋白的能力.[方法]利用CRISPR-Cas技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)脂多糖生物合成途径中的lpxM,改变其毒性中心类脂A的侧链结构;在...     

一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1菌株γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh 的克隆、表达及酶学性质

【目的】γ-丁基甜菜碱羟化酶是生物体内合成L-肉碱的关键酶。从假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1中克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为生物转化生产L-肉碱奠定基础。【方法】通过PCR克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET-15b;表达产物经His.Bind Resin纯化后对BBH进行酶学性质及三维空间结构分析;并以静止细胞进行L-肉碱的转化。【结果】成功地克隆了一个γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh(GenBank:JQ250036),并实现了其在E.coli中的高效表达。融合蛋白以同源二聚体的形式存在,单个亚基的分子量约46.5 kDa,最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。该酶在45℃以下稳定。在pH6.0时该酶有最高的pH稳定性。以表达bbh基因的重组大肠杆菌静止细胞转化L-肉碱,L-肉碱产量可达12.7mmol/L。【结论】Pseudomonas sp.L-1γ-丁基甜菜碱羟化酶与现有报道的bbh基因有较大的差异。由该基因表达的γ-丁基甜菜碱羟化酶能有效地转化γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱。本研究不仅丰富了γ-丁基甜菜碱羟化酶基因资源,而且为L-肉碱的生物转化提供了一种新的转化方案。     

利用大肠杆菌工程菌廉价高效生产聚羟基丁酸酯

利用大肠杆菌生产聚羟基脂肪酸酯是近来国际上生物可降解塑料的研究热点,本研究通过对适宜于聚羟基脂肪酸酯生产的大肠杆菌菌株的选择和碳源利用试验,初步确立了大肠杆菌代谢工程改造生产聚羟基脂肪酸酯的基础。并在此基础上,通过对大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶系统的改造和工程菌环境诱导系统的应用,解决了大肠杆菌工程菌无法同时利用多种碳源合成聚羟基脂肪酸酯的难题。发酵试验证明,工程化改造的大肠杆菌利用廉价底物在5L发酵罐中分批培养32h后,菌体终浓度能够达到8.24g/L,聚羟基脂肪酸酯占细胞干重的84.6%。     

基因敲除提高大肠杆菌工程菌生产异丁醇产量的研究

探究pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株对大肠杆菌工程菌发酵生产异丁醇的影响。运用Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113的pflB、frdAB、fnr和AdhE基因,构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株E.coliBW25113H,结合本实验室已经构建的表达质粒pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA,并检测该工程菌在1L发酵罐的发酵过程中的生物量、突变菌株的稳定性、异丁醇产量及有机酸含量的变化情况。成功获得pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H。发酵结果表明,该工程菌能以较长时间,较高比生长速率保持对数生长期,其稳定性较好,异丁醇产量增加了40%。成功构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H,结合非自身发酵途径使异丁醇的产量由3 g/L提升至4.2 g/L。     

Characterization of the eicosapentaenoic acid biosynthesis gene cluster from Shewanella sp. strain SCRC-2738.

The 38 kb eicosapentaenoic acid (EPA) biosynthesis gene cluster of Shewanella sp. strain SCRC-2738 was cloned into the cosmid vector (pEPA). A 27 kb nucleotide sequence of the XhoI to SpeI region of pEPA showed EPA production (6.3%) in E. coli JM109. Among the nine open reading frames (ORFs) in this sequence, only five (ORFs 2 and 5-8) were essential for EPA production. High levels of production (16%-22%) were found in E. coli JM109 transformed with a multicopy pNEB vector carrying only the five essential ORFs and in that transformed with a pNEB vector that integrated ORFs 3, 5, 6, 7 and 8, and vector pSTV28 that integrated the ORF2 encoding phosphopantetheinyl transferase (PPTase). Thus, production of EPA appears to be regulated by the presence of all the biosynthesis gene products and by the ratio of PPTase to the other gene products. The temperature -EPA production relationship in E. coli strain DH5alpha varied between constructs, suggesting that it is controlled not only by EPA biosynthesis enzymes but also by other factors in vivo. There was a strict upper temperature limit for EPA biosynthesis: no EPA was synthesized at 30 degrees C in E. coli transformants carrying any gene construct for EPA biosynthesis.     

Enhanced production of D-(-)-3-hydroxybutyric acid by recombinant Escherichia coli

Wild-type bacteria including Escherichia coli normally do not produce extracellular D-(-)-3-hydroxybutyric acid (3HB). To produce extracellular chiral 3HB, a new pathway for synthesis of 3HB was constructed by simultaneous expression of genes of beta-ketothiolase (phbA), acetoacetyl-CoA reductase (phbB), phosphor-transbutyrylase (ptb) and butyrate kinase (buk) in E. coli strain DH5alpha. E. coli DH5alpha containing any one of the four plasmids pBHR69, pUCAB, p68CM or pKKAB that harbor the phbA and phbB genes produced small amounts of 3HB, ranging from 75 to 400 mg l(-1), while E. coli DH5alpha harboring p68CMPTK containing genes of phbA, phbB, ptb and buk increased the 3HB concentration to 1.4 g l(-1) in shake flasks supplemented with LB broth and 20 g l(-1) glucose. 3HB production was further improved to over 2 g l(-1) in shake flasks when E. coli DH5alpha hosted two plasmids simultaneously that separately contained phbA and phbB in one plasmid while ptb and buk in the other. A batch fermentation run in a 5-l fermenter produced approximately 5 g l(-1) 3HB after 24 h. A fed-batch process increased 3HB production to 12 g l(-1) after 48 h of fermentation.     

长梗木霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达

【目的】以实验室筛选获得的一株长梗木霉GM2(Trichoderma longibrachiatum)为材料,克隆出其β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)基因bgl并在大肠杆菌和酵母中进行表达。【方法】利用同源克隆扩增出其β-葡萄糖苷酶基因bgl全长序列,分别亚克隆到质粒pET-32a(+)和pPICZα-B中,构建其原核表达载体pET32a(+)-bglI和真核表达载体pPICZα-B-bgl。【结果】bgl基因序列全长2 369 bp,含两个内含子,编码744个氨基酸。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达bgl,重组蛋白以包涵体形式存在,上清液中没有β-葡萄糖苷酶的酶活。将载体pPICZα-B-bgl电转化入毕赤酵母GS115,得到78 kD左右重组蛋白,与预测大小相符。按9%接种量接入50 mL YP培养基(初始pH 5.5),30°C振荡培养96 h,添加终浓度1%的甲醇诱导后β-葡萄糖苷酶酶活达60 U/mL。重组酶bgl催化水杨苷水解反应的最适pH为5.0,最适温度为70°C;另外,此bgl在pH 3.0 10.0和40°C 60°C范围内具有比较好的稳定性。【结论】长梗木霉GM2的β-葡萄糖苷酶在P.pastoris中获得可溶性表达,并证明有一定的活性。