美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P~(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p~(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p~(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p~(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p~(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p~(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p~(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因（afp）导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因供体ＤＮＡ,用花粉管通道和子房注射方法导入番 茄品种“中蔬四号”中,对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带;田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份４．４℃条件下,转基因组植株生长势优于对照;致死温度也比对照降低２℃、说明ａｆｐ基因已整合转化番茄基因组并获得表达。     

美洲拟鲽抗冻肽基因在E.coli中的表达

动物抗冻肽（ＡＦＰ）以降低动物体液冰点而使其能在寒冷的环境中生活,因而ＡＦＰ在防寒抗冻方面有较大的潜力。根据美洲拟鲽ＡＦＰ基因的ｃＤＮＡ序列,人工合成了ＡＦＰ及春含前导序列的ｐｒｏＡＦＰ的ｃＤＮＡ,并构建成ＰＡＦＰ及ＰＰＡＦＰ原核表达载体。由于ＡＦＰ表达量少且蛋白分子很小,用ＳＤＳ－蛋白电泳难以检测。为了提高检测的灵敏度,把报道基因ＣＡＴ的ＣＤＮＡ按读码框连接到ＡＦＰ的３＇末端,构建成融合基因表达     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

转美洲拟鲽抗冻蛋白基因（AFP）番茄的叶片电导率测定

对转美州拟鲽抗冻蛋白基因（ＡＦＰ）的第三代（Ｄ３）番茄及其对照,经低温处理后进行幼苗叶片组织电导率测定,发现转基因各组电导率均比对照明显降低,说明导入的ＡＦＰ基因已经表达并使番茄获得抗寒性。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因(afp)导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因作为供体ＤＮＡ,用花粉管通道和子房注射方法导入番茄品种“中蔬四号”中,对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带;田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份４·４℃条件下,转基因组植株生长势优于对照;致死温度也比对照降低２℃．说明ａｆｐ基因已整合到转化番茄基因组并获得表达     

转美州拟鲽抗冻蛋白基因(AFP)番茄的叶片电导率测定

对转美州拟鲽抗冻蛋白基因（ADP）的第三代（D3）番茄及其对照,经低温处理后进行幼苗叶片组织电导率测定,发现转基因各组电导率均比对照明显降低,说明导入的AFP基因已经表达并使番茄获得抗寒性。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化番茄的形态学与苹果酸脱氢酶同工酶检测

将带有afp基因的Ti质粒pMon(232),作为供体DNA,用花柱道和子房注射DNA的方法转化番茄品种“中蔬四号”对D1D2代进行田间抗寒性观察,发现在春季平均气温低于正常年分4．4℃条件下,有些组分田间长势明显好于对照。初步确认已获得抗寒性。对D2代转基因植株进行MDH同工酶分析,均与对照有明显差异,间接验证了外源DNA的导入,说明同工酶分析,可作为转基因植株早期筛选的生化指标。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体

用限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的ｐＣＴ５质粒,分离得到３２４ｂｐ的片段,将此片段亚克隆到ｐＵＣ１９质粒中,筛选到ｐＵＣ－ＡＦ重组子。从ｐＵＣ－ＡＦ重组子中,用ＢａｍＨＩ和ＨｉｒｄⅢ切下３２４ｂｐ的抗冻蛋白基因,再重组到含有ＳＶ４０病毒启动子的ｐＫＳＶ－１０的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究 ,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时 ,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害 ,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

美洲拟鲽抗冻肽基因在E.coli中的表达

动物抗冻肽(AFP)能降低动物体液冰点而使其能在寒冷的环境中生活,因而AFP在防寒抗冻方面有较大的应用潜力。根据美洲拟鲽AFP基因的cDNA序列,人工合成了AFP及其含前导序列的proAFP的cDNA,并构建成pAFP及pPAFP原核表达载体。由于AFP表达量少且蛋白分子很小,用SDS-蛋白电泳难以检测。为了提高检测的灵敏度,把报道基因CAT的cDNA按读码框连接到AFP的3′末端,构建成融合基因表达载体pAFP/CAT和pPAFP/CAT。在大肠杆菌表达系统JM109(DE 3)中诱导表达。结果表明,融合蛋白AFP/CAT和proAFP/CAT具有明显CAT活力。这表明AFP和proAFP可以在大肠杆菌中表达。     

抗冻蛋白结构基因片段的克隆

为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成了抗冻蛋白１１０ｂｐ的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体Ｐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ⅱｋｓ＋／－上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。     

低温对转抗冻蛋白基因罗非鱼影响的初步研究

本文阐述了逐渐降低水温对转抗冻蛋白基因罗非鱼生存影响的初步观察结果。用３０尾转抗冻蛋白基因罗非鱼,从２２℃开始,以２℃／ｈ下降至７℃,发现在９℃有６尾死亡,７℃又有１０尾死亡,有１４尾存活,但有不同表现,从存活１４尾鱼和死亡的６尾鱼中提取总ＤＮＡ,作原位杂交,有１０尾为阳性,再从这１０尾呈阳性鱼肝中分离总ＲＮＡ,作ＲＮＡ—ＤＮＡ杂交并未发现阳性结果,表明有外源ＤＮＡ的整合,但未发生转录或弱的转录,不过有部分转基因鱼表现出具有耐低温能力。     

利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)基因的非抗冻功能进行验证,将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA,纯化后注射黄粉虫幼虫,通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA,命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后,Tmafps的表达受到显著抑制,相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。     

美洲王蝶迁徙“导航仪”位于触角

每年10月底,上亿只美洲王蝶从美国东北部和加拿大南部,向西南方向飞越数千公里来到温暖的墨西哥中部林区繁衍,尔后自然死亡。来年3月,这些王蝶的后代会飞回原来的栖息地。美国研究人员9月24日公布的研究结果显示,指引王蝶迁徙的“导航仪”实际上位于其触角内,而不是此前普遍认为的大脑中。     

几种拟除虫菊酯类杀虫剂对美洲斑潜蝇的防治效果

测定了拟除虫菊酯类农药功夫、灭扫利、速灭杀丁和兴棉宝对美洲斑潜蝇各龄幼虫、雌成虫的毒力以及对成虫取食、产卵的影响,并进行了田间小区试验。结果表明：美洲斑潜蝇一、二、三龄幼虫和雌成虫对功夫最敏感,一、二、三龄幼虫对功夫的 ＬＣ５０分别是 ０．００７５、０．００９３、０．０１１２ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ,雌成虫对功夫的 ２４小时、４８小时的 ＬＣ５０分别是０．００２７、０．００２５ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ。功夫对美洲斑潜蝇的取食、产卵拒避持效期分别是 ４天和 ６天,用浓度 ０．０２５ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ的功夫药液处理 ０、２、４、６天后接虫,幼虫存活率分别是０、６．３％、６．８％和 ６１．６％,田间用浓度 ０．０２５、０．０１６７ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ功夫分别处理,６天的校正虫口减退率分别是９１．９６％和８３．６０％。     

美洲商陆中新发现的一种抗菌蛋白基因的克隆和表达

自美洲商陆(PhytolaccaamericanaL.)的种子中发现了一种具有38个氨基酸残基的蛋白(PaAFP),它有明显抑制立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKiihn)作用。依此蛋白的氨基酸序列合成引物,从该种子的mRNA中,通过逆转录PCR,获得了这一基因的具有65个氨基酸的前体蛋白cDNA序列(已在GenBank注册),将这一成熟蛋白的cDNA克隆在pGEX4T1上,并转化到大肠杆菌(E.coli),融合蛋白被大量表达。表达产物经谷胱甘肽Sepharose4B亲合层析,融合蛋白被纯化。纯化后的融合蛋白经凝血酶(thrombin)作用,将谷胱甘肽S转移酶降解,从而获得这一抗真菌蛋白     

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因的克隆和抗冻活性分析

根据GenBank中已发表的昆虫抗冻蛋白基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术结合3'-RACE扩增的方法,从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲 Microdera punctipenis dzunarica中获得了长约294 bp不含信号肽的抗冻蛋白cDNA片段,命名为MpAFP5,其全长序列为363 bp(GenBank注册号为：AY821792)。基因测序结果表明, MpAFP5-cDNA片段与加拿大拟步甲Dendroides canadensis AFP 8基因片段、黄粉甲Tenebrio molitor THP 4-9基因片段的核苷酸同源性分别达68.4%和71.8%,氨基酸序列同源性分别达70%和81%。将MpAFP5构建到原核表达载体pGEX4T-1中,重组质粒pGEX4T-1-MpAFP5在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达融合抗冻蛋白,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为37 kD,Western印迹分析证明MpAFP5在大肠杆菌中正确表达。细菌的抗冻实验结果显示准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白对细菌具有显著的抗冻保护作用,保护效果与抗冻蛋白剂量呈正相关性。     

昆虫抗冻蛋白基因的克隆与表达研究进展

产生抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是许多昆虫抵御寒冷的一种重要机制。昆虫抗冻蛋白基因的克隆和表达是研究抗冻蛋白活性和功能的主要途径。文章归纳GenBank所登录的昆虫抗冻蛋白基因及其特点,总结昆虫抗冻蛋白基因的天然表达和基因工程表达方面尚未明确或需要克服的一些问题。目前在GenBank注册的昆虫抗冻蛋白基因约100个,集中于9种昆虫隶属鞘翅目3个科和鳞翅目1个科。昆虫抗冻蛋白基因具有多拷贝和多同种型(isoforms)的特点。昆虫抗冻蛋白的天然表达具有物种间和同种型间的多样性。基因工程表达昆虫抗冻蛋白需要克服表达量低活性不高的问题。对昆虫抗冻蛋白表达规律的研究有助于全面认识其功能。     

低温下转昆虫抗冻蛋白基因烟草的亚显微结构变化

分析在-1℃温度中处理1、2和3d的转昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149烟草和野生型烟草亚细胞显微结构变化的结果表明,转基因烟草和野生型烟草的超微结构有差异,尤其是细胞膜、叶绿体和线粒体的膜。转基因烟草细胞器的膜结构伤害程度明显低于野生型烟草,这提示低温条件下转基因烟草中的抗冻蛋白可能有保护细胞膜和细胞器膜结构的作用,由此降低了低温的伤害。