绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(Aequoria victoria)体内的一种发光蛋白,近十年来成为在生物化学和细胞生物学研究和应用中用得最广泛的蛋白质之一。文章就绿色荧光蛋白的特性及其在植物分子生物学中应用的研究进展作了概述。     

绿色荧光蛋白及其在细胞生物研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为一种新型的标记蛋白,已被广泛的应用。它发出的荧光稳定,检测简单,结果真实可靠。GFP可对活细胞的生理过程进行监控,并且可以用于活细胞中蛋白质分子的定位及动力学研究。其特有的生物化学性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。     

细胞器荧光蛋白标记稳定细胞株系的建立与应用

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）以及由其演变而来的突变体或来自于其他物种的各色荧光蛋白,因为良好的荧光激发特性、稳定的真原核细胞表达及较小的细胞毒性等特点,被广泛应用为蛋白质定位的重要标记分子和报告基因,在生命科学的诸多研究领域得以应用。     

荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。     

绿色荧光蛋白

来源于水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一. 其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时（λ_max=395 nm, 小峰在479 nm）可高效发射清晰可见的绿光. GFP的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会. GFP已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记. 通过突变和蛋白质工程构建的GFP嵌合蛋白在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景.     

绿色荧光蛋白(GFP)在真菌研究中的应用

绿色荧光蛋白(gteen fluorescent protein,GFP)来源于海洋生物水母(Aequorea victoria),由于其具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点,以GFP为报告基因已经被广泛地应用于真菌的分子生物学研究中。GFP基因通过随机插入真菌基因组的方法,已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等;GFP基因通过与目标基因融合的方法,则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋白质功能等研究。     

基于GFP的FRET应用

绿色荧光蛋白（GFP）是一种活性荧光标记,已被用来研究基因表达、分子定位,蛋白质折叠和转运;荧光共振能量转移（FRET）是一种无损伤的光学检测方法,能检测到小于纳米的距离变化。将GFP的活性定位标记功能与FRET的高分辨率相结合。为活体研究生物分子的功能和命运开创了新的篇章。作者在介绍GFP和FRET原理的基础上,综述了基于GFP的FRET在蛋白酶活性,蛋白质间相互作用 构象改变研究中的应用。     

绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来 ,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP ,来源于水母 )具有独特的应用价值。在活体研究中 ,GFP相对于其它报告蛋白 (如 β 半乳糖苷酶 )在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾 ,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论 ,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。     

绿色荧光蛋白及其应用

绿色荧光蛋白是在水母中发现的新型报告分子,能在多种生物体内表达并发出荧光。对GFP中一些特定氨基酸进行突变可以产生多种类型的突变体,有利于研究蛋白之间或细胞器之间的相互作用。目前,GFP已经用于基因表达的报告、细胞动态的研究、活细胞内蛋白的定位及westernbloting检测中。GFP美好的应用前景也促进了有关GFP的研究,特别是寻找新的突变体并将之运用到细胞生物学和分子生物学的各个领域。     

奇特的蛋白质

据估计生物界中的蛋白质可达 10 10 ～ 10 12 ,有的作为功能蛋白发挥着及其重要的生理功能 (酶蛋白、运输蛋白、运动蛋白、免疫球蛋白等 ) ;有的为不具活性功能的储藏蛋白 (鸟卵清蛋白、牛奶酪蛋白 )和结构蛋白 (毛发角蛋白、结缔组织中的胶原蛋白 )。其实除了这些蛋白质外尚有一类奇特的蛋白质 ,它们有的能发光 ,有的与抗冻有关 ,有的能提高酶的活性 ,有的与耐热性有关 ,有的有杀菌作用。1　绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 ( GFP)是 Douglas等在 1992年最早纯化得到的能发光的蛋白质 ,因其独特的发光特性引起人们极大的兴趣 ;它能在长波紫外光…     

Glutamate Receptor-interacting Protein 1 Protein Binds to the Microtubule-associated Protein

To identify the interaction proteins for the α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate (AMPA) receptor subunit glutamate receptor-interacting protein 1 (GRIP1), GRIP1 interactions with microtubule-associated protein (MAP)-1B light chain (LC) were investigated. GRIP1 interacts with MAP-1A and MAP-1B in the yeast two-hybrid assay, as is indicated also by glutathione S-transferase (GST) pull-down and coimmunoprecipitation with MAP-1B LC antibody in brain fractions. These results suggest a novel mechanism for localizing AMPA receptors to synaptic sites.     

植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白研究进展

综述了近十年来国内外有关研究植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白的文献。着重阐述了磷胁迫和铁胁迫条件下的植物蛋白质变化,如新的蛋白和新的多肽的特异产生,以及相关的分子生物学进展。     

丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MK)研究进展

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路介导多种重要的细胞生理反应.对下游蛋白激酶的磷酸化是MAPK家族成员发挥生理作用的重要方式.在MAPK的下游存在3个结构上相关的MAPK激活蛋白激酶(MAPKAPKorMK),即MK2,MK3和MK5.在被MAPK激活后,MK可将信号传递至细胞内不同靶标,从而在转录和翻译水平调节基因表达,调控细胞骨架和细胞周期,介导细胞迁移和胚胎发育.最近,在基因敲除研究的基础上,不同MK亚族成员之间的功能区分已经逐渐明晰,使我们对于MK的认识有了长足的进步.     

植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白研究进展

综述了近十年来国内外有关研究植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白的文献,着重阐述了磷胁迫和铁胁迫条件下的植物蛋白质变化,如新的蛋白和新的多肽的特异产生,以及相关的分子生物学进展。     

运动神经元生存蛋白SMN与Sm蛋白的结合作用

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy,SMA）是一类与运动神经元存活基因（survival of motor neurons gene,SMN gene）突变有关的神经系统变性疾病,而SMN基因的转录产物即为SMN蛋白（survival of motorneurons protein,SMN protein）。SMN蛋白与多种蛋白结合后发挥作用,如SMN-Sm蛋白的相互作用在富含尿嘧啶的小核核糖核蛋白体（uridine—richsmallribonucleo—proteins,UsnRNPs）转运装配中有重要意义。SMN蛋白是通过其Tudor结构域与剪接体sm蛋白的二甲基化修饰的富含精氨酸一氨基乙酸域（ar—ginineandglycine—rich,RG）结合。     

规模化蛋白质相互作用的研究技术

蛋白质相互作用既是蛋白质执行功能的主要方式,也是细胞功能调控网络的结构基础。蛋白质间异常的相互作用及其连锁网络的紊乱是引起许多病理改变的原因。作为功能基因组和蛋白质组研究的重要内容,规模化蛋白质相互作用研究已成为近年国际上研究的热点之一。文章综述了当前规模化蛋白质相互作用研究中的常用技术和常用蛋白质相互作用数据库,研究者可根据研究需要和技术特点利用这些资源。     

Protein Solubility and Protein Homeostasis: A Generic View of Protein Misfolding Disorders

According to the “generic view” of protein aggregation, the ability to self-assemble into stable and highly organized structures such as amyloid fibrils is not an unusual feature exhibited by a small group of peptides and proteins with special sequence or structural properties, but rather a property shared by most proteins. At the same time, through a wide variety of techniques, many of which were originally devised for applications in other disciplines, it has also been established that the maintenance of proteins in a soluble state is a fundamental aspect of protein homeostasis. Taken together, these advances offer a unified framework for understanding the molecular basis of protein aggregation and for the rational development of therapeutic strategies based on the biological and chemical regulation of protein solubility.Virtually every complex biochemical process taking place in living cells depends on the ability of the molecules involved to self-assemble into functional structures (Dobson 2003; Robinson et al. 2007; Russel et al. 2009), and a sophisticated quality control system is responsible for regulating the reactions leading to this organization within the cellular environment (Dobson 2003; Balch et al. 2008; Hartl and Hayer-Hartl 2009; Powers et al. 2009; Vendruscolo and Dobson 2009). Proteins are the molecules that are essential for enabling, regulating, and controlling almost all the tasks necessary to maintain such a balance. To function, the majority of our proteins need to fold into specific three-dimensional structures following their biosynthesis in the ribosome (Hartl and Hayer-Hartl 2002). The wide variety of highly specific structures that results from protein folding, and which serve to bring key functional groups into close proximity, has enabled living systems to develop an astonishing diversity and selectivity in their underlying chemical processes by using a common set of just 20 basic molecular components, the amino acids (Dobson 2003). Given the central importance of protein folding, it is not surprising that the failure of proteins to fold correctly, or to remain correctly folded, is at the origin of a wide variety of pathological conditions, including late-onset diabetes, cystic fibrosis, and Alzheimer’s and Parkinson’s diseases (Dobson 2003; Chiti and Dobson 2006; Haass and Selkoe 2007). In many of these disorders proteins self-assemble in an aberrant manner into large molecular aggregates, notably amyloid fibrils (Chiti and Dobson 2006; Ramirez-Alvarado et al. 2010).     

p53相关蛋白激酶结合蛋白CGI-121

利用酵母双杂交技术从人的睾丸cDNA文库中鉴定得到p53相关蛋白激酶(PRPK)结合蛋白CGI-121,体外实验表明,重组CGI-121能抑制PRPK磷酸化p53第15位的Ser,未磷酸化p53进入泛素蛋白酶体途径,导致细胞增殖或肿瘤发生;然而,体内过表达CGI-121并没有显著的抑制PRPK磷酸化p53.Michael Downey等在研究cdcl3基因缺陷型酿酒酵母中筛选得到cdcl3-1突变体的抑制基因CGI-121,CGI-121是真核生物一个新的保守复合物--KEOPS复合物组成之一.KEOPS复合物具有促进端粒延伸和使端粒拆开的功能.CGI-121突变体在热敏感cdcl3-1酵母突变株中可以减少ssDNA的积累和缩短端粒;同时,在端粒功能异常芽殖酵母中CGI-121和piD261/Bud32促进端粒的拆开.然而,基因调控自身表达的机制以及在PRPK信号途径和KEOPS复合物中的扮演的角色有待于进一步研究.     

SARS冠状病毒核壳蛋白对蛋白翻译的影响

目的:研究SARS冠状病毒核壳蛋白(N蛋白)对蛋白翻译的影响。方法:构建N蛋白表达载体FLAG-pcDNA3-N,分别与FLAG-pcDNA3和表达荧光素酶的质粒共转染293T人胚肾细胞,通过检测荧光素酶的活性来判断N蛋白对细胞内蛋白翻译的影响;在体外翻译体系中检测N蛋白对体外翻译的影响。结果:构建了载体FLAG-pcDNA3-N,在293T人胚肾细胞内表达后,荧光素酶活性被抑制;在体外翻译体系中加入N蛋白,体外翻译被抑制。结论:SARS冠状病毒N蛋白抑制蛋白翻译。     

肌动蛋白集束调控因子及G蛋白信号转导通路

细胞骨架由微丝、微管及中等纤维组成受不同蛋白因子调控以不同方式组装成不同直径的纤维 ,遍布于一切细胞 ,决定细胞的形状 ,赋予其抗压强度 ,对细胞器及大分子进行空间组织 ,实现胞内的能量转换。在肌动蛋白 (ａｃｔｉｎ)组装成张力纤维和张力纤维解离成肌动蛋白单体过程中有多种蛋白因子参与调控 ,从而使细胞骨架处于一个生理的动态平衡中 ,执行和完成不同的生化反应。在众多的调控蛋白中 ,肌动蛋白集束调控蛋白因子 (ａｃｔｉｎｂｕｎｄｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ)不仅参与肌动蛋白结构调节 ,还与细胞内信号传导有密切关系。已发现的肌动蛋…