菜心苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析

通过同源克隆和RACE相结合的方法,首次从菜心中克隆了苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的全长cDNA,命名为BcPAL1(GenBank登录号为GU245694).BcPAL1全长2 476 bp,开放阅读框2 166 bp,编码721个氨基酸.经氨基酸序列多重比较发现,BcPAL1编码的氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜等植物的PAL氨基酸序列同源性大于90%,BcPAL1编码的氨基酸序列包含与拟南芥、烟草PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点.基于氨基酸序列的PAL系统进化树分析结果显示,BcPAL1编码的氨基酸序列与十字花科类植物(如拟南芥)的PAL聚为一支,说明两者的亲缘关系较近.     

砀山酥梨果实苯丙氨酸解氨酶基因cDNA克隆及序列分析

为了研究梨石细胞形成与木质素合成的关系,以砀山酥梨果实为材料,通过基于同源性的RT—PCR方法,克隆木质素合成途径中的关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因。同时利用基因数据库资料对克隆的PAL序列进行比较分析。结果表明,从砀山酥梨果实中克隆的PAL基因eDNA片段长度为585bp,推断其编码195个氨基酸序列。该序列包含与其它植物PAL相同的活性催化位点,经序列分析和同源性比对,该氨基酸序列与其它植物PAL氨基酸序列的同源性在90％以上。系统进化树分析表明,砀山酥梨PAL氨基酸序列与蔷薇科的甜樱桃PAL氨基酸序列聚类关系最近。     

宁夏枸杞DFR基因的克隆与序列分析

根据已报道植物二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因cDNA序列的保守区域设计引物,对宁夏枸杞(Lycium barbarum)DFR基因进行克隆及序列分析.结果表明,宁夏枸杞DFR基因cDNA全长1140个碱基,有一个1116个核苷酸的开放阅读框,编码一个长372个氨基酸的蛋白质;氨基酸序列的聚类分析显示,宁夏枸杞LbDFR1与马铃薯、烟草、蕃茄等茄科植物的DFR亲缘关系较近,其中与马铃薯DFR亲缘关系最近,相似性为92％;通过编码蛋白的三级结构预测,该蛋白为单体模式,具有酶学的生物特征;宁夏枸杞LbDFR1在宁夏枸杞的根、茎、叶等组织中广泛表达,为组成表达型基因.     

宁夏枸杞PLA基因家族cDNA片段的克隆及其生物信息学分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC 4.3.1.5)是一种主要的调控酶,在植物体内通过催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸来联系初级和次级代谢。本文以宁夏枸杞为材料,利用序列同源原理设计简并引物和RT-PCR技术得到4条PAL基因片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该家族的cDNA片段长为1 162~1 183 bp,推导编码554~561个氨基酸,蛋白分子量为60.681~61.250 kD,等电点为7.02~7.71。枸杞PAL基因家族彼此间的氨基酸序列变异度为0.005%~0.336%。氨基酸序列和结构分析显示PAL基因家族有一个保守区域,即屏蔽结构域,以及一个活性位点——苯丙氨酸/组氨酸解氨酶位点。LyPAL1~3蛋白很可能定位在线粒体,而LyPAL4蛋白很可能定位在细胞质。二级结构和三级结构进行预测,发现LyPAL1蛋白中无规则卷曲179个,α螺旋和β折叠分别306和30个,延伸链46个。系统进化分析表明,枸杞LyPAL1~3基因与辣椒的PAL基因具有很高的同源性,而枸杞LyPAL4基因与碧冬茄属的三种植物(Petunia axillaris,Petunia x hybrid,P exserta)具有很高的同源性。这4个基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为KC759153~KC759156。4个LyPAL基因的克隆为进一步研究宁夏枸杞类黄酮等次级代谢物的合成分子机制研究奠定了基础。     

木质素生物合成酶CCR基因的生物信息学分析

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是催化木质素特异途径的第一个关键酶,是调节碳素流向木质素潜在的控制关节点,对木质素单体的生物合成起着重要作用。通过NCBI数据库收集来自裸子植物、单子叶植物及双子叶植物的35条CCR基因的完整信息,对35条CCR基因的cDNA及其编码的氨基酸序列的进化规律、理化性质、结构域、导肽、信号肽、跨膜结构域、亲/疏水性以及蛋白质结构等性状进行了生物信息学分析与预测,构建了CCR基因的系统发育树。分析结果表明,单子叶植物CCR基因中GC的含量明显高于双子叶植物;CCR基因编码的氨基酸序列存在9个保守区域;所编码氨基酸的理化性质基本一致,但单子叶、双子叶及裸子植物的CCR基因编码主要氨基酸的种类和含量存在着差异;CCR蛋白的N-端存在一个脱氢酶/差向异构酶/辅酶Ⅰ结合蛋白的结构域,无导肽、信号肽及跨膜结构域,属亲水性蛋白;进化树绘制以及同源建模结果表明,CCR基因的进化和植物的进化基本一致,CCR蛋白三级结构模型的空间结构稳定,建模结果可靠。分析结果对于深入研究CCR蛋白在木质素合成中的作用具有一定的理论指导意义。     

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。     

基于转录组测序的慈竹笋木质素基因筛选及其表达分析

慈竹（Bambusa emeiensis）纤维素含量丰富,是较好的造纸原料,但竹茎中木质素影响着制浆生产及纸浆质量。目前,对慈竹木质素生物合成机制所知甚少,这限制了遗传调控竹木质素的研究。本文以拟南芥、水稻等植物的已知木质素基因作为查询序列,通过BLASTp和系统进化分析,从10、50、100和150 cm慈竹笋转录组数据中筛选到351个木质素生物合成相关Unigenes,包括51个LAC,37个4CL、26个PAL、34个CCR和25个CAD相关转录子,其数量高于其他已报道的竹类植物。转录丰度和定量基因表达分析发现16个木质素基因,包括2个PAL、5个CCR、3个4CL、2个CADH2和4个LAC,随着笋发育而表达上调,表明其可能与发育性木质素积累相关。     

独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

以独一味叶片为材料,采用RT-PCR和RACE方法克隆了独一味苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的全长cDNA,命名为LrPAL基因。测序结果表明,LrPA L基因全长2 298 bp,含有1个2 145 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码714个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树分析表明,独一味LrPAL与唇形科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。用 Real-Time PCR方法检测发现,LrPAL基因在独一味的叶中表达量最高,茎中表达量最少。研究结果推测,从独一味中克隆获得的苯丙氨酸解氨酶基因（LrPAL）是典型的PAL家族成员,在独一味各组织发育过程中具有重要功能。     

板栗咖啡酸氧甲基转移酶基因CmCOMT的克隆及原核表达

该研究根据板栗(Castanea mollissima Bl.)cDNA文库分析得到EST序列,采用RT-PCR技术,克隆板栗咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)基因全长cDNA(CmCOMT),分析其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究,为板栗木质素合成关键酶基因CmCOMT的生物学功能研究与应用奠定基础。结果表明:(1)CmCOMT基因(GenBank登录号为KU365322)具有一个1 098bp开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,推测蛋白分子质量为39.684 9kD,理论等电点为5.83,具有植物SAM依赖甲基转移酶的典型特征。(2)CmCOMT核苷酸序列及其编码氨基酸序列与垂枝桦(Betula pendula)和白桦(Betula platyphylla)的相应序列一致性均在90%以上;同源建模表明,CmCOMT的3D模型与苜蓿(Medicago sativa)MsCOMT的蛋白结构相似,推测其可能与MsCOMT具有相似的功能;系统发育树分析显示,CmCOMT与其他植物COMTs具有相同的进化祖先,与桦木科植物物种亲缘关系最近。(3)SDS-PAGE电泳分析表明,CmCOMT蛋白最佳诱导表达条件为0.3mmol/L IPTG在25℃下诱导6h,蛋白分子量约为44kD,其主要以可溶性蛋白的形式存在。     

异叶天南星苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与蛋白结构分析

以异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume)为材料,采用逆转录PCR(RT-PCR)法扩增其苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因Ah PAL,获得该基因的开放读码框(ORF),并通过系统的生物信息学软件分析Ah PAL的结构和理化性质。结果显示,Ah PAL的ORF全长为2184 bp,编码727个氨基酸;Ah PAL与郁金香(Tulipa fosteriana W. Irving) PAL的亲缘关系最近,序列相似性达88%。空间结构模型分析结果显示,Ah PAL为同型四聚体,每个单体由3个结构域组成,其中MIO结构域含有PAL酶家族的保守序列和Ala-Ser-Gly三肽活性中心,是Ah PAL酶活性的决定性结构域。利用荧光定量PCR方法检测3个Ah PAL Unigene在根、块茎和叶中的表达情况,发现它们在根中表达量均最高,而在叶和块茎中表达较低。     

低氧气调包装对去壳雷笋褐变和木质化的影响

研究了在厚度为0.04 mm的聚乙烯(PE)袋内充气成分为2%O2、5%CO2和93%N2于10℃下贮藏时气调袋装去壳雷笋褐变和木质化进程.与对照相比,低氧气调包装(MAP)抑制了去壳雷笋贮藏前期丙二醛(MDA)的生成,显著抑制了过氧化物酶(POD)(P＜0.05)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性(P＜0.01),最终显著抑制了笋肉的褐变(P＜0.01),显著抑制了木质素(P＜0.05)和纤维素的合成,从而延长了保鲜期.去壳雷笋的褐变可能由POD和PAL活性作用引起.POD和PAL活性的增加也可能诱导了木质素的合成.     

Cloning of genes encoding a 15,000-dalton peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein and an antigenically related 15,000-dalton protein from Haemophilus influenzae.

We have cloned and expressed in Escherichia coli a gene encoding a 15,000-apparent-molecular-weight peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein (PAL) of Haemophilus influenzae. The nucleotide sequence of this gene encodes an open reading frame of 153 codons with a predicted mature protein of 134 amino acids. The amino acid composition and sequence of the predicted mature protein agree with the chemically determined composition and partial amino acid sequence of PAL purified from H. influenzae outer membranes. We have also identified a second gene from H. influenzae that encodes a second 15,000-apparent-molecular-weight protein which is recognized by antiserum against PAL. This protein has been shown to be a lipoprotein. The nucleotide sequence of this gene encodes an open reading frame of 154 codons with a predicted mature protein of 136 amino acids and has limited sequence homology with that of the gene encoding PAL. Southern hybridization analysis indicates that both genes exist as single copies in H. influenzae chromosomal DNA. Both genes encode polypeptides which have amino-terminal sequences similar to those of reported membrane signal peptides and are associated primarily with the outer membrane when expressed in E. coli.     

Characterization of 10 KDA prolamin genes in Phyllostachys aurea (Bambusoideae, Poaceae)

Prolamin is the dominant class of seed storage protein in grasses (Poaceae). Information on the 10 kDa multigene family coding for prolamins characteristic of the bambusoid-oryzoid grasses is limited. Two genes encoding 10 kDa prolamin were cloned and sequenced in the bambusoid species Phyllostachys aurea to assess the sequence diversity of this gene family in the oryzoid-bambusoid grasses. The genes, ~417 bp in length, were 96% similar at the DNA sequence level, differing in 12 base substitutions dispersed throughout the sequence. Eight of these mutations were nonsynonymous, leading to amino acid substitutions in the coding region, and one was nonsense, producing an amber stop codon. One gene had an open reading frame (ORF) of 139 amino acids, while the other gene had a shorter ORF (106 amino acids) due to the presence of a stop codon in the coding region and, thus, represents a pseudogene. Deduced proteins showed amino acid composition similar to that of rice. The study underscores the overall conserved nature of this multigene family and reflects considerable sequence divergence at the DNA and amino acid levels between the Oryza and the Phyllostachys genes. The systematic implication of the data is discussed in light of the inconsistent placement of Oryza in the Bambusoideae or Oryzoideae.     

毛竹SWEET基因家族的全基因组鉴定与分析

糖外排转运蛋白(Sugars will eventually be exported transporters, SWEETs)在植物生理活动和发育过程中起重要作用。为探究SWEET基因家族在毛竹(Phyllostachys edulis)的生长发育过程中起的作用,基于毛竹基因组数据,通过生物信息学方法对SWEET基因家族成员进行鉴定,并对其编码的蛋白质理化性质、系统进化及共线性关系、基因结构、启动子元件及表达模式、蛋白互作网路分析、GO注释等进行细致分析。研究结果表明:该家族基因结构、基序和结构域相对保守,所有成员均含有MtN3_slv结构域。上游启动子序列中含有多个同非生物胁迫以及生长发育相关元件,结合转录组表达量分析显示,多个家族成员在毛竹不同组织器官均有表达。共线性分析揭示毛竹SWEET家族在演化过程中存在全基因组多倍化事件。蛋白互作网路分析挖掘出2个重要核心家族成员,GO注释分析进一步证实毛竹SWEET主要负责体内糖类物质的转运。以上结果为毛竹SWEET基因功能鉴定提供了重要参考,对于毛竹快速生长分子机制研究打下了基础。     

毛竹PsbS基因的克隆及其原核表达特征研究

采用RT-PCR技术从毛竹(Phyllostachys edulis)叶片中克隆到1个PsbS基因,命名为PePsbS (GenBank No. FJ600727),其编码区为810 bp,编码269个氨基酸。序列分析表明,PePsbS编码的蛋白与其它单子叶植物的PsbS蛋白有很高的相似性。蛋白结构分析表明,PePsbS基因编码蛋白包含导肽部分和成熟蛋白,其中成熟蛋白包含4个跨膜结构域。将PePsbS基因编码成熟蛋白的序列构建到原核表达载体pET23a中,并转入大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达。结果表明, 41℃下诱导4 h的表达效果最好,目的蛋白含量约占总蛋白的21.5%,分子量约为22.0 kD。这说明温度和诱导时间明显影响PePsbS基因的表达。     

香蕉（‘威廉斯突变体’）苯丙氨酸解氨酶基因克隆、表达及酶活性分析

选用抗枯萎病突变体‘威廉斯突变体(Musa spp.AAA,Williams Mutant)'为试材,用RT-PCR技术从香蕉叶中克隆得到一个长为1 504 bp,编码501个氨基酸的苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA序列.序列分析与其它植物PAL蛋白有较高同源性,尤其是麻疯树和柑橘属同源性高达93%.半定量PCR和酶活性测定被采用研究威廉斯突变体在接种枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp.cubense.roce 4(FOC4)茎中PAL表达的变化,结果显示茎中PAL活性呈规律性变化,且均高于同期对照,与其它植物相关研究结果类似,表明PAL与香蕉抗枯萎病密切相关.