Pichia pastoris X-33 ΔGT2缓解甘油对AOX1的阻遏并用于外源蛋白的高效表达

巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母,作为应用最广泛的真核表达系统之一,在以甲醇为唯一碳源时可以利用醇氧化酶启动子PAOX1进行外源蛋白的表达,但是这一过程会被甘油阻遏。近几年有研究表明,甘油转运体不仅有运输甘油的功能,还与甘油、甲醇的代谢有一定的联系。目的:构建了甘油转运体GT2(PAS_chr3_1076)缺失菌株P.pastoris X-33ΔGT2,研究该菌株的甘油去阻遏效应和在不同碳源培养基中诱导PAOX1启动子驱动外源蛋白的表达水平。方法:构建以甲醇诱导型启动子PAOX1调控外源基因EGFP的表达载体PAOX1-EGFP,经酶线性化后电转野生型菌株P.pastoris X-33获得重组菌株x-EGFP;通过同源重组的方法敲除GT2基因,获得ΔGT2-EGFP敲除菌株;以ΔGT2-EGFP和X-EGFP为出发菌株,在甘油、甲醇,以及甘油甲醇混合为碳源诱导醇氧化酶AOX1及绿色荧光蛋白EGFP的表达和生长情况,并检测在以甘油为唯一碳源时,胞外的甘油含量。结果:在以甘油甲醇混合碳源培养时,突变体ΔGT2-EGFP菌株中AOX1单位酶活比野生型菌株高出近35%,单位荧光强度要高出近70%;在以甘油为唯一碳源时,X-EGFP最终收获时的生物量比ΔGT2-EGFP多,且发酵液中甘油含量相对较少;以混合碳源培养时ΔGT2总外源蛋白表达水平最高。结论:实验表明,GT2参与甘油的吸收与代谢,ΔGT2突变株可在一定程度上解除甘油对甲醇的代谢抑制,暗示甘油转运体与PAOX1相关,且基于此研究结果有望优化出更高效的酵母表达系统。     

毕赤酵母醇氧化酶1启动子突变体的分离与鉴定

目的：通过醇氧化酶1启动子突变,筛选毕赤酵母高水平表达菌株。方法：通过致错PCR构建醇氧化酶1启动子突变体,经酶切连接到改造过的质粒HSA-pPIC9上,转化毕赤酵母GS115感受态细胞,摇瓶培养表达筛选人血清白蛋白（HSA）高表达突变体菌株。结果：克隆测序结果表明,突变的醇氧化酶1启动子-910和-569位点处共2个碱基发生了T→C突变;获得一株高表达菌株,摇瓶中HSA的表达量由200mg／L提高到335mg／L。结论：通过醇氧化酶1启动子突变成功构建了HSA高表达菌株。     

准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测

以开发利用新疆濒危鱼类准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)基因资源为研究目的, 利用PCR技术克隆准噶尔雅罗鱼的β-actin 基因, 得到的β-actin 基因片段SZ21包含启动调控区, 大小为2 398 bp。SZ21的启动调控区包括β-actin 基因上游调控序列、第1、第2、第3和第4外显子部分序列。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT框、TATA 框和CArG 框等元件。对启动子序列在线分析表明, 获得的启动子含有E-box、RU49、ZBPF、CEBP、CREB等多个重要转录因子结合位点。用AatⅡ破坏真核表达载体pEGFP-N1-AFPⅢ中的CMV启动子, 将准噶尔雅罗鱼的SZ21启动调控区克隆到载体pEGFP-N1-AFPⅢ(CMV坏)上, 构建成重组表达载体β2 pEGFP-N1-AFPⅢ。脂质体转染BHK-21细胞。结果表明, 克隆的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21具有启动EGFP报告基因在哺乳动物细胞中表达的活性。通过BHK-21绿色荧光细胞的传代证实, 克隆的启动子具有持续启动蛋白基因表达的活性, 在细胞传代中可以遗传。PCR检测传代的BHK-21绿色荧光细胞基因组DNA, 均能检测到SZ21目的片段。文章成功分离了具有活性功能的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子。     

鹅卵清蛋白基因5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出1．2kb的鹅清蛋白基因5’端调控区,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点(标记为pOV),经酶切和测序鉴定：扩增产物只有3个碱基发生了突变,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明鹅清蛋白基因5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列。为构建其启动外源基因的质粒表达载体奠定了研究基础。     

苏云金芽胞杆菌aiiA的5'端侧翼序列的克隆与功能鉴定

为了研究苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine Lactonase,AiiA蛋白)表达调控机制,确定aiiA的启动子区域。本研究克隆了aiiA的5'端侧翼区(aP-1930--1),以gfp作为报告基因,分段克隆aiiA的5'侧翼区,鉴定启动子活性,并对aiiA启动子序列中的碱基对-150和-142之间的2个连续的TATA盒进行定点突变。结果显示,侧翼序列aP-295--101和aP-295--1可作为启动子,实现GFP在大肠杆菌中的异源表达,启动子序列aP-295--101比aP-295--1活性更强,aP-101--1序列不能启动GFP表达。定点突变pET28a-aP-295--101-gfp载体2个TATA盒显著降低GFP表达。表明-295--1bp为aiiA的启动子区,-429--296与-100--1序列是aiiA的负调控序列。-150--142 bp区域的2个TATA盒对aiiA的5'侧翼区域的启动子活性起关键的作用。     

嗜热乙醇杆菌中醛/醇脱氢酶的双启动子分析

克隆了嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)中乙醇代谢的关键酶之一醛/醇脱氢酶(alcohol/acetaldehydedehy drogenase,AdhE)基因的上游假定启动子序列,并进行了结构分析。结果表明,adhE的上游序列是启动子,能启动报告基因在大肠杆菌中持续表达。首次发现adhE的启动子序列中存在两个独立的启动子(P172和P37)和核糖体结合位点(SD172和SD37),分别都具有完整功能,但其活性均低于完整的启动子序列。由此推测嗜热乙醇杆菌中adhE的表达受这两个启动子协同调控。     

大肠杆菌yigP基因转录调控序列的鉴定

【目的】调查yigP基因启动子的活性,并对该转录调控序列进行分析。【方法】以lacZ为报告基因,克隆启动子片段至启动子探针质粒中,通过检测β-半乳糖苷酶活性判断启动子活性,并通过克隆一系列逐步缩短的启动子片段来确定启动子所在区域。利用定点突变技术,对启动子的重要序列进行定点突变,调查其对启动子活性的影响。【结果】确定了yigP基因启动子的区域,鉴定了启动子的-10区和-35区,并发现了启动子上游存在一个负调控序列,对该序列进行了初步的研究显示其中部分序列是这种负调控作用的核心序列。【结论】对yigP基因的转录调控序列进行了鉴定,丰富了我们对基因转录调控的认识。     

贵阳腐霉Pr1基因上游调控序列的克隆及分析

目的:克隆贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶(Pr1)基因上游调控序列并进行分析,进一步了解Pr1基因的表达规律。方法:采用锅柄聚合酶链反应法(Panhandle PCR)扩增Pr1基因上游调控序列,并利用真核生物启动子分析软件对扩增序列进行启动子顺式作用元件预测分析。结果:获得864bp基因序列,分析表明,该序列包含2个TATA框,一个可能的转录起始区,并具备氮调控因子结合位点(相隔很近的GATA序列),碳调控因子结合位点(5’SYGGRG 3’)。这与Pr1的表达受碳/氮抑制的结果一致。结论:Panhandle PCR方法成功克隆贵阳腐霉Pr1基因上游调控序列,GenBank登录号为:JQ975036。     

唐鱼β-actin基因近端和远端启动子的鉴定及其启动活性分析

利用高保真PCR技术获得唐鱼(Tanichthys albonubes)长为1.3 kb的卢肌动蛋白(β-actin)的端启动调控序列(TA,1.3 kb).在此基础上采用基因组步移技术(Genome walker)获得5'侧翼上游序列1.7 kb,再根据所获的近端启动子序列和上游序列设计引物,扩增获得全长为3.0 kb的唐鱼β-actin基因远端启动调控序列(TLA,3.0 kb).此1.3 kb和3.0 kb启动调控序列均包含3个转录活性元件:CAAT Box(-89～-85),CArG Box(-59～-49),TATA Box(-26～-20).利用启动子分析软件TRANSFAC 6.0分析,结果显示启动调控序列(-105～1261)国含有E-Box、NF-Y、Spl等多个重要转录因子结合位点,在远端启动调控序列(-1719～1261)中还含有更多的重要转录因子结合位点.将这两个序列分别定向克隆到红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达载体中,构建重组表达载体pTLA-DsRed和pTA-DsRed,并分别注射到唐鱼受精卵中.结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼的阳性率较转pTA-DsRed的高,且所发出的红色荧光的强度也比后者的强.采用RT-PCR检测孵化后第15天的转基因唐鱼中RFP的mRNA,结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼中RFPmRNA的表达量比转pTA-DsRed基因唐鱼高35.7%.结果表明两种长度的启动调控序列均能有效驱使外源基因在唐鱼体内表达,且长度为3.0 kb的启动子序列具有更强的驱动活性.     

利用定点突变分析白念珠菌依赖铁基因FRP1启动子元件

通过对白念珠菌高铁还原酶基因FRP1启动子进行突变分析, 确认启动子中特殊调控元件。我们通过分析FRP1起始密码子上游1000 bp序列发现在-160 和-650处有2个推测的Rim101p结合位点, 对其分别进行定点突变, 然后构建启动子与报告基因LacZ融合质粒, 转化整合到白念珠菌rim101-/-株和野生株中, 检测不同缺铁条件下b-半乳糖苷酶活性。结果发现碱性条件, Rim101p能够正向调控FRP1的表达; 启动子-160处突变对启动子功能影响较弱, 而-650突变使启动子活性大大降低, 此结果和双突变的结果相同, 表明Rim101p主要通过与启动子-650处结合位点相互作用来调控FRP1的表达。     

梅PGIP基因的启动子克隆及生物信息学分析

根据梅PGIP基因(GenBank登录号:DQ364056.1)5′端序列设计特异反向引物,利用染色体步行法获得了该基因上游1 037 bp的启动子序列.启动子结构分析表明,梅PGIP基因启动子序列与中国李PGIP基因启动子显著相似,相似度达89%~96%,较中国李PGIP基因启动子多一个100 bp的区段,与水稻和豆的启动子序列均无Blast比对结果.转录调控元件预测结果表明,克隆序列与豆相应序列的保守区存在着能调控抗病基因转录的GT1结合位点.     

SigmaK和GerE对芽胞外壁基质结构基因exsB的转录调控

[目的]明确SigmaK和GerE对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)芽胞外壁(exosporium)基质结构基因exsB的转录调控.[方法]序列比较蜡样芽胞杆菌群exsB及启动区序列,利用启动子融合lacZ技术检测exsB启动子的转录活性;通过凝胶阻滞方法检测GerE与exsB启动子的结合.[结果]在蜡样芽胞杆菌群中,exsB及其启动区具有较高的相似性,exsB启动子在芽胞形成期的晚期大量转录;sigK和gerE的突变影响了exsB启动子的转录活性,凝胶阻滞结果显示GerE蛋白与exsB启动子可以结合.[结论]本研究证明exsB在芽胞形成晚期受到SigmaK转录调控,并直接受到GerE的正调控.     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

唐鱼b-actin基因近端和远端启动子的鉴定及其启动活性分析

利用高保真PCR技术获得唐鱼(Tanichthys albonubes)长为1.3 kb的b-肌动蛋白(b-actin)近端启动调控序列(TA, 1.3 kb)。在此基础上采用基因组步移技术(Genome walker)获得5￠侧翼上游序列1.7 kb, 再根据所获的近端启动子序列和上游序列设计引物, 扩增获得全长为3.0 kb的唐鱼b-actin基因远端启动调控序列(TLA, 3.0 kb)。此1.3 kb和3.0 kb启动调控序列均包含3个转录活性元件: CAAT Box(-89~-85), CArG Box (-59~-49), TATA Box(-26~-20)。利用启动子分析软件TRANSFAC 6.0分析, 结果显示启动调控序列(-105~1261)中含有E-Box、NF-Y、Sp1等多个重要转录因子结合位点, 在远端启动调控序列(-1719~1261)中还含有更多的重要转录因子结合位点。将这两个序列分别定向克隆到红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达载体中, 构建重组表达载体pTLA-DsRed和pTA-DsRed, 并分别注射到唐鱼受精卵中, 结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼的阳性率较转pTA-DsRed的高, 且所发出的红色荧光的强度也比后者的强。采用RT-PCR检测孵化后第15天的转基因唐鱼中RFP的mRNA, 结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼中RFP mRNA的表达量比转pTA-DsRed基因唐鱼高35.7%。结果表明两种长度的启动调控序列均能有效驱使外源基因在唐鱼体内表达, 且长度为3.0 kb的启动子序列具有更强的驱动活性。     

老年痴呆症相关基因Nicastrin的转录调控

APP蛋白经过降解,形成老年痴呆症患者脑内老年斑的主要成分.由PS(早老素),NCT,PEN-2和APH-14种膜蛋白组成的γ分泌酶催化该降解过程.为了了解人类nicastrin(NCT)基因的转录调控机制,确定了其在人脑中的转录起始位点以及其编码区上游大小不等片段的转录起始活性.EMSA分析证实NCT启动子区的4个AP-1结合位点和2个NFAT结合位点能够与相应的转录因子结合,能够改变转录因子调控能力的定点突变和PDTC诱导使得NCT启动子在HeLa细胞和人鼠皮质神经元中的启动活性都有所改变.以上结果说明:AP-1和NFAT确实参与了人类NCT基因的转录调控.     

鸡miR-17-92基因簇上游调控区功能分析

miR-17-92基因簇(miR-17-92 cluster)在细胞增殖、分化、凋亡、动物发育以及肿瘤发生等过程中发挥重要作用。目前,人和小鼠等哺乳动物miR-17-92基因簇的转录调控已有深入研究,但该基因簇在鸡等鸟类中的转录调控研究还未见报道,主要原因在于鸟类miR-17-92基因簇上游的基因组序列都存在一个gap,且该基因簇启动子的位置和序列也还不清楚。为此,本研究采用染色体步移的方法获得鸡miR-17-92基因簇上游gap区序列,并采用生物信息学分析和报告基因及截短突变技术开展该gap区的功能分析。染色体步移分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游gap区全长1704 bp,GC含量达80.11%。生物信息学分析显示,鸡miR-17-92基因簇上游gap区内1段200 bp的序列与人、牛、小鼠等9种动物miR-17-92基因簇上游序列保守性较高,且该区域为人和小鼠等哺乳动物miR-17-92基因簇宿主基因的核心启动子区。将克隆的gap区序列插入pGL3 basic荧光素酶报告基因载体,构建成启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)。荧光素酶报告基因活性分析表明,pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)报告基因的活性是pGL3 basic空载体活性的417倍,证明所克隆的gap区片段是鸡miR-17-92基因簇宿主基因的启动子。为进一步分析该启动子的结构和功能,构建gap区片段的5°端缺失突变(缺失448 bp)和3°端缺失突变(缺失894 bp)的荧光素酶报告基因载体。与pGL3-cMIR17HG(-4228/-2506)相比,5°端和3°端缺失突变分别使启动子报告基因活性降低19.82%和60.14%。这些数据提示,鸡miR-17-92基因簇宿主基因启动子的重要调控区位于-3400/-2506。本研究结果为进一步开展鸡miR-17-92基因簇的转录调控奠定了基础。     

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1可从转录水平阻断胶原基因的激活     

橡胶树白粉菌(HO-73)启动子WY172不同长度片段的克隆及表达活性分析

旨在克隆橡胶树白粉菌启动子WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段,以分析启动子各片段的表达活性。基于实验室前期研究基础,以WY172上游2K序列作为研究对象进行渐变缺失突变,得到4个不同长度的可能具有启动子活性的片段,结合WY172,选用pBI121载体作为骨架,分别替换GUS基因前的CaMV35S启动子,并分别构建重组表达载体,通过ATMT法转化农杆菌;利用GUS染色法和酶活性检测,分析WY172启动子及不同长度片段的酶活性。分别构建了pBI121-WY172、pBI121-WY172Q、pBI121-WY172Q1、pBI121-WY172Q2、pBI121-WY172Q3共5个重组的植物表达载体,所有植物表达载体烟草瞬时表达GUS染色均有蓝色出现,且蓝色程度均强于阳性对照CaMV35S启动子,其中pBI121-WY172Q3的GUS染色相对最深;GUS酶活性测定结果显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于CaMV35S启动子,WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。因此我们判断WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段均具有启动子活性,其中以WY172Q3启动子片段的表达活性最强。     

MvaT调控铜绿假单胞菌吩嗪的合成机制

【背景】属于H-NS家族的MvaT转录因子参与了铜绿假单胞菌的许多重要代谢过程,如吩嗪合成代谢,但其调控方式仍不十分明确。【目的】确定转录调控因子MvaT是否直接调控铜绿假单胞菌的吩嗪合成过程,即该蛋白是否可以直接结合2个吩嗪-1-羧酸合成基因簇(phzA1G1和phzA2G2)与3个分支转化基因(phzH、phzS和phzM)的上游启动子区域。【方法】以铜绿假单胞菌SJTD-1和其mvaT基因敲除突变株SJTD-1(ΔmvaT)为研究对象,检测其在不同培养基条件下吩嗪化合物的合成量差异。通过体外异源表达与亲和纯化,获得重组蛋白MvaT。利用凝胶阻滞实验,确定MvaT重组蛋白对5个吩嗪代谢基因簇/基因上游启动子的结合情况。【结果】mvaT基因敲除突变株SJTD-1(ΔmvaT)的吩嗪产量较野生型显著提升。MvaT重组蛋白被有效表达与纯化,体外凝胶阻滞实验结果显示,该重组蛋白可与phzA1G1、phzA2G2、phzM、phzS和phzH的上游启动子区域均发生特异性结合。其中,重组蛋白MvaT与phzA1G1和phzA2G2的结合区域位于其上游启动子的200 bp以内,而该蛋白与phzM、phzS和phzH的结合区域则位于其上游启动子的100 bp以内。【结论】MvaT蛋白通过直接结合吩嗪合成代谢基因的上游启动子区域来直接调控假单胞菌的吩嗪类化合物合成。     

家蚕云7A Sericin1基因启动子克隆及活性分析

家蚕Sericin1基因(Ser1)是中部丝腺特异表达基因,其启动子在家蚕生物反应器研究方面发挥着重要作用。为了解云南家蚕品种云7 Ser1基因上游调控序列存在的多态性,进而获得具有驱动活性的Ser1启动子序列,克隆了家蚕Ser1基因启动子并进行序列分析,构建了由该基因启动子驱动红色荧光蛋白基因Ds Red的表达载体p Bac[Ser1p-Ds RedSV40+A3-EGFP],转染家蚕Bm N细胞进行瞬时表达来验证启动子活性。该启动子同已报道Ser1基因上游调控序列比对发现,顺式作用元件区域高度保守,而其他区域存在422 bp的碱基缺失;Ser1基因上游调控序列中存在启动子TATA框和CAAT框分别位于-24~-30处和-112~-115处,其中TATA框的保守序列是TATAAAA;而启动子驱动下的Ds Red基因在Bm N细胞和中部丝腺中成功表达。结果表明云南家蚕品种Ser1上游调控序列存在多态性和驱动活性,为了解不同家蚕品种丝胶合成能力差异和获得高效启动子奠定了基础。