大熊猫人工授精的研究

繁殖大熊猫的目的是圈养种群的自我维持和保持遗传多样性。由于圈养种群中有自然交配能力的雄兽很少 ,人工授精则成为有效的遗传管理的重要手段。本研究的目的是确定单纯人工授精的效率。 1 998年至 2 0 0 0年期间 ,在中国保护大熊猫研究中心 ,对 7只大熊猫进行了人工授精 (每只连续 2d) ,精液通过人工采精方法从 6只不同的雄兽中获得 ,使用鲜精、冷藏精液和冻精多种方法进行人工授精。 6只雄兽的精液平均值是 :采精量 3.3±0 .5ml;精子密度 1 ,42 9.8± 2 35 .4× 1 0 6/ml;活力 81 .7± 2 .1 % ;运动状态 ( 0～ 5 ,5 =最好 )3 1± 0 .1 ;精子正常率 79 3± 9.2 %。对 7只大熊猫进行的 1 4次人工授精中 ,使用的精液体积为 2 4± 0 3ml;活力是 73.5± 2 .9% ;运动状态为 2 .5± 0 .1 ;每次人工授精总活动精子数是 684.2± 1 1 8.2× 1 0 6。 7只大熊猫有 4只受孕 ( 5 7.1 % ) ,共产 5仔。平均孕娠期 1 31 .5±9.7d ,每胎平均 1 .3± 0 .3仔。同时 ,运用自然交配与人工授精相结合的方法 ,进行了 1 8只次实验 ,成功 1 2只次 ,产仔 2 0只 ,繁殖成功率为 66.7%。本研究结果表明 ,人工授精能有效地使不能自然交配的雄性大熊猫参与繁殖 ,提高繁殖率 ,增加圈养大熊猫的遗传多样性。     

大熊猫精液常温保存初探

大熊猫繁殖困难的一个重要因素就是具有交配能力的雄兽极少。采用冷冻精液人工授精在国内外均获成功,但冷冻精液过程复杂,费用较高。我们于1984—1985年对常温保存大熊猫精液做了一些试验,现总结如下。健康但无交配能力的雄兽两只均选自大熊猫研究中心饲养场。用氯胺酮和龙朋麻醉,电刺激采精,常温保存。稀释液配方为:氯化钠5.54g,氯化钾0.356g,无水氯化钙0.253g,磷酸二氢钾0.162g,硫酸镁0.294g,碳酸氢钠2.106g,丙酮酸钠0.028g,乳酸钠2.416g,葡萄糖1.000g,牛血清白蛋白10.000g,青霉素、链霉素各50,000单位,重蒸水加至1000ml。按配方准确称取…     

圈养大熊猫冷冻精液对其种群遗传多样性的作用

在过去34年的圈养大熊猫种群保护工作中,我们成功建立了全球最大的大熊猫精子库,目前已保存50只大熊猫个体总计7 000余支细管冷冻精液(冻精)。冷冻精液一方面可以使物种的遗传资源得到长久保存,另一方面可以通过人工授精的方式促进种群繁育。但是,圈养大熊猫冷冻精液对其种群遗传多样性的作用尚未有明确报道。本研究首先根据成都大熊猫繁育研究基地2000—2014年冷冻精液人工授精数据,对比分析了冻精人工授精个体和圈养种群的遗传多样性。结果显示,冻精人工授精个体遗传多样性均高于同年圈养种群的平均遗传多样性,表明在繁殖年份中冻精人工授精可以显著提高圈养大熊猫种群的遗传多样性。统计精子库中所有冻精个体的平均血缘系数并与圈养种群进行对比分析,探究冷冻精液对圈养种群遗传多样性的潜在作用。结果显示,精子库中有21只已死亡个体的精液,其中有66.67%的个体平均血缘系数低于圈养种群;有14只20岁以上个体的精液,其中有50.00%的个体平均血缘系数低于圈养种群;另有15只20岁以下个体的精液,其中有53.33%的个体平均血缘系数低于圈养种群,表明冷冻精液对圈养种群遗传多样性的保护具有重要价值。综上所述,冷冻精液不但有效保存了大熊猫遗传资源,而且在保护圈养种群遗传多样性方面具有积极的促进作用。     

攸县麻鸭DMA细管精液冷冻技术研究

为利用冷冻精液保存地方鸭品种资源,以笼养攸县麻鸭公鸭(日龄170 d)为试验对象,检测其精子密度与活力,对精液稀释液渗透压进行筛选;将活力在0.5以上的精液以6%二甲基乙酰胺(dimethylacetamide,DMA)作为冷冻保护剂,用便携式简易专利技术装置,将细管精液置于液氮面上约2 cm高度熏蒸冷冻7 min后浸入液氮10 min以上,随后40℃水浴解冻10 s,检测解冻精子活力;将精子活力在0.3以上的细管精液在液氮中保存,待收集到足够细管精液后对相近周龄临武鸭母鸭进行输精。结果显示:1)在不同渗透压稀释液中,精子体外存活时间以LR液303 m Osm/kg组最佳,其活力与273 m Osm/kg组差异不显著(P>0.05),与215 m Osm/kg组差异显著(P<0.05); 2)采集的原精平均活力中,诱情方式的为0.71,按摩方式的为0.61; 3)诱情方式冻精液的平均活力为0.33,活力在0.3以上的冻精输精组的受精率为85.93%,鲜精组为88.17%,且冻精最高批次平均受精率达93.8%。本文精液冷冻方法为我国鸭乃至禽类延长公禽在后裔测定中的种用期限,利用精液冷冻保存种质资源,弥补活体保种的不足等领域的研究与应用提供了技术支撑。     

利用不同稀释剂对长期保存的猪精液质量检测

目的：由于冷冻保存的猪精液在解冻后会出现低成活率和低繁殖率的情况,本项目研究猪精液的低温长期保存和保存后的精子质量评定。方法：本实验选用目前常用的BTS,ANDROHEP,KIEV,ZORLESCO等四种稀释剂,将猪新鲜精液进行稀释（1：1）后分别于17℃保存15天,每天取样对精子的质量进行评价,利用荧光染料Hoechst 33258和SYBR－14／碘化丙碇（PI）分别检测精子死活;利用活体荧光染料JC－1检测精子线粒体活性;利用考马斯亮兰染色检测精子顶体状态;利用金霉素（CTC）检测精子是否获能。结果：SYBR－14／PI和Hoechst 33258两种方法检测精子死活都很灵敏,前检测的活精子比例较后稍高,但都低于JC－1检测的线粒体有活性的精子比例,说明精子线粒体活性损失要慢于质膜完整性的破坏;活精子比例和线粒体活性在保存的前8天都是缓慢减少,获能比例和顶体状态分别在第9－14天和第11天变化较大,利用AN和ZO保存13天,BTS保存10天以及KIEV保存9天的精液中精子的活率,顶体完整率及线粒体有活性的比例仍高于50％,提示这些精液仍可用于人工授精或体外受精,这四种稀释剂保存15天后的精子获能比例接近70％,Hoechst33258,SYBR-14,JC-1,考马斯亮兰检测结果亮度相关。结论：这四种稀释剂对精子的低温保存效果依此为：AN＞ZO＞BTS＞KIEV。     

不同配种方式对大熊猫产仔效果的影响

１９８７－１９９３年,我国人工圈养的大熊猫先后有３１只雌性受配１０８只次,产仔胎,获幼仔４５只。有１６只雄性参加配种,其中７只能进行自然交配,９只没有自然交配能力。从３只雄性采出的良好精液,能使雌怀孕产仔,怀孕率为１９．１２％。在雄性自然交恿前后再给雌兽化人工授精,能提高雌兽怀孕产仔效果,来自不同山系大熊猫的繁殖能力有不同程序的差异,尤以岷山山系大熊猫的繁殖效果较差。     

大熊猫冷冻精液解冻速度和解冻液中添加Pentyoxyfilline对其解冻后活力的影响

建立大熊猫的精子库,进行远距离圈养大熊猫种群间的人工授精和遗传物质的转运,维持遗传多样性,是目前大熊猫遗传管理的优先方法。要成为最有效的工具,精子库保存的精子解冻后的活力必须很好。本文对大熊猫冷冻精液的解冻速度和解冻液中添加化学激活剂Pentyoxyfilline(PF)后的精子活力进行了试验。试验用的精液采自11只成年大熊猫,精液冷冻速度为每分钟-40℃～-100℃。试验Ⅰ:将冷冻精液放入3种不同温度的水浴中解冻:(1)22℃(慢速解冻);(2)37℃(中速解冻)(3)50℃(快速解冻)。将冷冻前精子活力(78 1±2 9%)和解冻后的平均精子活力进行比较,快速解冻后的精子活力(57 5±5 4%)显著地降低(P<0 05),而中速解冻的精子活力(67 5±3 1%)和慢速解冻的精子活力(73 33±2 1%)与冷冻前的活力接近。试验Ⅱ:使用中速解冻方法解冻精液后,分别加入最终浓度为0mM、1mM、5mM和10mM的PF,然后分别保温15min和24h。在PF(0mM、1mM、5mM和10mM)中分别孵育15min的解冻精子活力,运动状态,活率和顶体正常率在试验期的90min内都很相似(P>0 05)。在1mMPF中孵育24h的精子活力没有变化(P>0 05)。在5mM和10mMPF中孵育过的精子活力(5mM:24 0±4 7%;10mM19 5±3 6%)比没有加PF的对照组的精子活力(38 3±5 2%)显著地低(P<0 05)。而且,在10mM     

大熊猫精液超低温冷冻的比较

对卧龙自然保护区大熊猫研究中心的9只雄性大熊猫电刺激采精,比较研究了稀释液中甘油含量、精液离心、不同稀释液和冷冻方法对大熊猫精液超低温冷冻保存后的活力、运动状态和顶体的影响。稀释液中甘油的含量为4％－5％较好,冻精解冻后的活力和顶体的正常率能保持鲜精的一半。离心和未离心的精液经超低温冷冻,解冻后的活力和运动状态都较接近。TEST和SFS两种稀释液的效果没有明显的差异。细管的冷冻过程较颗粒方便、快捷,时间容易控制,是一种较好的超低温冷冻精液的方法。     

不同稀释液对圈养黑熊精液品质的影响

对23头圈养黑熊进行63次电刺激采精,并在对精液进行品质检查的基础上,通过对3种稀释液4℃保存精液结果的筛选比较试验,得出以下结果:圈养黑熊采精量平均为1.06±0.93ml,pH值为6.71±0.44,精子密度为(3.23±1.68)×108个/ml,精子畸形率为(23.48±7.95)%,顶体完整率为(88.58±3.86)%,精子活率和活力分别为(76.30±13.91)%和(63.91±18.53)%;Tris-柠-果-葡-卵稀释液保存圈养黑熊精液效果最好,可作为进一步研究优化的首选。     

北京动物园大熊猫繁殖记录

北京动物园在三十年中,共繁殖大熊猫28胎（其中双胎18次）,产仔46只,成活21只,成活率为45．65％,为大熊猫的迁地保护作出了杰出的贡献。1963年第一次在人工饲养下自然繁殖成功大熊猫“明明”;1978年第一次用人工授精方法繁殖成功大熊猫“元晶”;1980年第一次以纯超低温保存的大熊猫冷冻精液人工授精成功产下二仔;1987年第一次在人工饲养下繁殖出子三代;1990年第一次实现不同地理位置的大熊猫自然交配繁殖成功幼仔“亚庆”;1992年第一次繁殖成功大熊猫人工授精第三代幼仔“京京”;1992年第一次以人工授精繁殖长大的雄性大熊猫自然交配成功繁殖“永明”和“永亮”;1992～1993年第一次以人工哺育的方法使未食母乳的大熊猫幼仔“永亮”成活;1993年第一次达到1992年所产的3仔全部成活,成活率为100％。     

大熊猫精清血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)活性影响因素的初步探讨

在2004年度2~5月大熊猫繁殖季节,对5只不同年龄雄性大熊猫的精液使用酶免法检测精清中的PAF-AH含量,并初步探讨了其含量高低的影响因素。结果在所有受检样品中均检测到PAF-AH活性的存在,浓度最低仅12.96 mmol/min.mL,最高达275.42 mmol/min.mL,大熊猫年龄不同、采精时间不同,精清PAF-AH含量存在一定差异;同时PAF-AH的含量表现出与精子活力呈极显著负相关(R=-0.73,P<0.001),与精子运动状态呈显著负相关(R=-0.58,P<0.05);与精子形态完整性也有一定相关性但差异不显著(R=-0.42,P>0.05)。结果表明,大熊猫精清中含有PAF-AH,其含量高低与大熊猫年龄、采精季节及精液质量有关。     

季节与采精频度对大熊猫精液品质的影响

对成都地区8只成年雄性大熊猫的采精季节和采精频度进行研究,结果提示大熊猫精液品质有显著的季节差异,12、1、6月虽能采集列精液,但品质较差,2、5月适中,3、4月份的精液品质最好;采精频度以间隔14天为最佳,7、21天次之,28天最差。     

白鹤冷冻精液人工授精实验

为了探索鹤类精液冷冻保存和使用技术,2003～2005年,进行了白鹤(Grus leucogeranus)的冷冻精液保存及人工授精实验。使用Beltsville家禽精液稀释液作为白鹤精液稀释液,12%的二甲基亚砜(DMSO)为冷冻液。精液样本冷冻经过三个阶段的降温,最后保存在液氮中。成功保存了编号93001雄性白鹤精液36 支（0.2 ml/支）。冷冻精液在0~4℃冰水中解冻3~5 min,解冻后白鹤精液精子活率为29.3%±15.5%（n=16）,2004和2005年分别为92101号雌鹤产的两窝卵进行人工授精实验,2年共产卵5枚,其中1枚卵受精并成功孵化。实验发现在雌鹤产卵前一周和产卵期间每天输精,并增加每次输精量,同时在产完1枚卵后4 h内完成一次输精,效果最佳。     

冷冻—解冻猪精子的超微结构观察

自从50年代初Polge发现甘油有卓越的防冻作用以后,动物精液冷冻技术发展很快。现在,奶牛和羊冷冻精液已广泛应用于人工授精和体外受精中,效果与鲜精接近,而猪冷冻精液在人工授精后虽也能产仔,但妊娠率与每窝产仔数均下降(Johnson等,1981);体外受精率可达85％以上,但精子浓度需用5—6×10_7精子/ml,比鲜精用量提高25—100倍(Wang等,1991)。顶体形态正常精子的减少是造成冷冻精液受精率低的重要原因之一(Pursel,1979),用光镜不能清楚地观察顶体的形态变化,但运用电镜技术对猪冷冻-解冻精子的顶体形态的超微结构研究报道不多(Courtens等,1985;Hashizume,1990)。针对猪冷冻—解冻精子体内/体外受精能力降低的问题,我们用透射电镜对冷冻的猪精子解冻0 h及4 h后精子顶体与头部质膜的超微结构变化进行了观察。     

鲢、鲤、团头鲂和草鱼精液冷冻保存的研究

本文对鲢、鲤、团头鲂和草鱼四种鱼精液的低温生物学特性及冷冻保存技术进行了研究。筛选出适合这些鱼类精液冷冻保存的理想稀释液配方。查明了冷冻处理导致精子膜破损、使精子谷草转氨酶及其它蛋白质大量逸出进入精浆的原因,而二甲亚砜通过升高精子渗透压和降低冰点可以明显减轻这种冷冻损伤效应。确定了有效的二甲亚砜浓度为8—12％。比较了玻璃安瓿法和塑料管法对精子冷冻保存效果的影响。筛选出了能提高冻精活力和延长运动时间的激活—授精溶液。探讨了精卵授精量比与冻精受精率之间的关系,确定了获得高受精率(80％)所需的最低冻精密度为0.5×10~6精子/卵。获得了短期(几天)和长期(1年)冷冻保存的草鱼和鲢冻精活力稳定在60—75％,受精率稳定在80—90％,鲤和团头鲂冻精活力稳定在55—65％、受精率稳定在70—80％,冻精授精鱼苗的孵化率稳定在75—95％的结果。     

秦岭大熊猫精液的细管冷冻保存

2008年3月1日至4月27日和2009年3月3日至5月1日,在陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心对处于繁殖期内的4只雄性秦岭大熊猫(Ailuropoda melanoleuca qinlingensis)精液进行了细管冻精实验。比较组成不同的4种稀释液:葡萄糖-果糖-柠檬酸三钠-卵黄-甘油-双抗(稀释液1)、葡萄糖-蔗糖-柠檬酸三钠-卵黄-甘油-双抗(稀释液2)、葡萄糖-柠檬酸三钠-卵黄-甘油-双抗(稀释液3)和美国进口的TEST(加入3.5%甘油),以及直接降温平衡法(方法 1)与逐级降温平衡法(方法 2)2种冷冻保存操作方法,对秦岭大熊猫精液进行细管冷冻保存后精子活力和顶体完整率的影响。结果表明:稀释液1的精子活力为46.25%±11.67%,顶体完整率为80.75%±7.89%,TEST的精子活力为48.75%±8.54%,顶体完整率为84.50%±7.59%,两者的精子活力和顶体完整率均无明显差异(P0.05),但是都明显高于稀释液2(P﹤0.01)和稀释液3(P﹤0.01);采用方法 1冷冻保存秦岭大熊猫精液,解冻后精子的活力和顶体完整率分别为45.67%±10.54%和81.37%±8.42%,都显著高于方法 2(P﹤0.01);方法 1解冻后畸形率为23.50%±3.51%,明显低于方法 2(P﹤0.01)。经比较确定,方法 1(用稀释液1)是一种较好的细管冷冻保存秦岭大熊猫精液的方法。     

我国应用冷冻猪精液首次成功

我国从1973年开始在广东、广西等省、区相继开始进行公猪精液冷冻实验。广西畜牧所应用在液氮(-196℃)中保存1—27天的精液(解冻后精子活率为0.3～0.5)试配了部分母猪,最近将陆续产仔。     

猪的冷冻精液试验

我们开展猪的冷冻精液试验,从1975年开始至1977年2月,已取得了实际产仔效果,14头母猪产了仔,平均每窝产仔9.57头,但授精效果颇不一致,初产母猪授精14头,情期受胎率50％,平均每窝产仔11.5头(8—14);经产母猪授精78头,情期受胎率14.1％,平均每窝产仔8.1头。目前正在继续开展提高冷冻精液授精效果的试验。现将试验的情况介绍如下。一、精液冷冻方法目前采取颗粒冷冻的主要操作程序,包括采精、过滤、稀释、降温、平衡、滴冻、保存等流程。 (一)采精用拳握法采集公猪精液,取其最浓稠部分,用灭菌的细纱布滤去精液中的胶状物质,然后检     

大熊猫精液品质的研究：精子和非精子的细胞成分超微结构观察

本文对刚接近性成熟大熊猫的精液在电子显微镜下进行精液品质鉴定,观察结果,除少量完成变态的精子外,多数是处在精子发生的各阶段并发育不正常,精液中伴随着大量巨噬细胞和被吞噬的衰亡精子及其碎片。镜检结果不仅说明这只雄性大熊猫性尚未成熟,其生殖系统可能还伴有生理或病理现象,这样的精液建议不能用于配种。     

哺乳动物精子冷冻的抗氧化研究进展

人工授精是迄今为止应用最广泛并最有成效的辅助生殖技术,而高品质的精液是提高人工授精受胎率的关键。近年来在家畜精液冷冻保存技术中应用抗氧化剂的研究受到广泛关注,通过添加抗氧化剂降低了精子在冷冻保存过程中所遭受的氧化损伤,提高了冷冻精液质量和母畜的受胎率。可添加的抗氧化剂种类很多,通常有维生素类和酶类抗氧化剂等。针对目前抗氧化剂在大熊猫精液上应用研究甚少的现状,该文对哺乳动物精子的氧化损伤机制和常用的抗氧化剂进行综述,期望对大熊猫的相关研究提供理论依据和参考。