多核苷酸的3′-端磷酰化

本文报导了一种使寡聚核苷酸3′-端磷酰化的新方法。其原理是用多核苷酸磷酸化酶(PNPase),使7-甲基鸟苷5′二磷酸(m~7GDP)在引物存在下聚合,然后在温和的化学条件下,选择性消去7-甲基鸟苷(m~7G)。我们应用两种三核苷二磷酸CpCpA,CpUpC 作引物,结果成功地合成了两种三核苷酸CpCpAp,CpUpCp。此方法还可用于多核苷酸的3′-~(32)P 标记。     

可溶性核糖核酸的研究 Ⅲ.酵母可溶性核糖核酸中抗碱二核苷酸的分离与鉴定

利用Tomlinson和Tener的DEAE-纤维素柱层析方法,我们从酵母SRNA的碱水解产物分得抗碱二核苷酸的层析峰。将抗碱二核苷酸混合物用大肠杆菌碱性磷酸单酯酶处理后,纸层析分离可得到四个部分,分别称A_1,A_2,A_3及A_4。经鉴定A_1为2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(G'pG),A_2主要为2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(C'pG,纯度约为87%),A_3则至少合2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(C'pA)和2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(G'pA),A_4较为复杂,未最后鉴定。因此酵母SRNA中至少含有下列四种抗碱二核苷酸:2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(G'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(C'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(C'pAp)及2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(G'pAp)。除此以外,还得到核苷二磷酸的层析峰,其中主要为鸟便嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸,只有少量的腺嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸。     

次黄嘌呤核苷-5-二磷酸钡盐的制备

次黄嘌呤核苷-5′-二磷酸(5′-IDP)是多聚核苷酸磷酸化酶的底物,也是制备多聚次黄嘌呤核苷酸(poly I)的基本材料。后者与poly C在一定条件下以等克分子混合后,按碱基配对原理,形成双链多核苷酸poly I:C。它是目前最有效的干扰素诱导物,具有使用剂量小,诱导效价高等优点。关于IDP的制备方法有:发酵法、有机合成法和腺腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)脱氨法。其中以ADP用亚硝酸脱氨法最为简便。但以往报道的方法,均过于简略,脱氨程度难以掌     

DNA聚合酶Ⅰ

1957年科恩伯格(A.Kornbeng)通过测定放射性标记的[~(14)C]胸苷三磷酸参入DNA的能力,发现一种催化DNA合成的酶。这种酶现在叫做DNA聚合酶Ⅰ或Pol Ⅰ,为含有928个氨基酸残基的多肽单链。酶促反应的底物是4种脱氧核苷三磷酸。反应需要DNA模板和一小段与模板互补的多核苷酸引物。反应中,引物或生长中DNA链的3′羟基与新参入核苷酸的α-磷酸基结合。反应     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5’-半分子顺序14～22九核苷酸的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子中二氢尿嘧啶环区的九核苷酸AGDCGGGDAG的合成工作。合成的方案是采用先合成AGD、CGG和DAG三个三核苷二磷酸片段,然后再以AGD pCGGDAG(3 p6)或AGDCGG pDAG(6 p3)两种方式用T_4RNA连接酶连接成为所需要的九核苷酸。CGG和DAG是采用磷酸二酯法进行化学合成,AGD是用AG>P同D借核糖核酸酶N_1酶促合成。这个路线的优点是三个三核苷二磷酸片段易于大量合成制备,无论是3 p6或6 p3两条路线的中间产物AGDCGG(产率61%)和CGGDAG(产率64%)和最终的九核苷酸产物都能得到好的连接产率和分离纯度。3 p6和6 p3两条路线所得的九核苷酸的连接产率分别为52%和82%。合成的产物均经过毗邻分析,5′末端~(32)P标记后的电泳-同系层析双向纯度鉴定或凝胶电泳以及核苷酸顺序分析证明了合成产物的均一性和结构的正确性。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5'-半分子顺序14～22九核苷酸的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸5'-半分子中二氢尿嘧啶环区的九核苷酸AGDCGGDAG的合成工作。合成的方案是采用先合成AGD、CGG和DAG三个三核苷二磷酸片段,然后再以AGD pCGGDAG(3 p6)或AGDCGG pDAG(6 p3)两种方式用T_4 RNA连接酶连接成为所需要的九核苷酸。CGG和DAG是采用磷酸二酯法进行化学合成,AGD是用AG>P同D借核糖核酸酶N_1酶促合成。这个路线的优点是三个三核苷二磷酸片段易于大量合成制备,无论是3 p6或6 p3两条路线的中间产物AGDOGG(产率61%)和CGGDAG(产率64%)和最终的九核苷酸产物都能得到好的连接产率和分离纯度。3 p6和6 p3两条路线所得的九核苷酸的连接产率分别为52%和82%。合成的产物均经过毗邻分析,5'末端~(32)P标记后的电泳-同系层折双向纯度鉴定或凝胶电泳以及核苷酸顺序分析证明了合成产物的均一性和结构的正确性。     

多核苷酸合成的研究 Ⅺ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子中含N,N-二甲基鸟苷的四核苷三磷酸(CpGpCpm_2~2G)的合成

(1)参照已报道方法,从鸟苷合成了N,N-二甲基鸟苷(m_2~2G)。(2)N、2′、5′-O-三苯甲酰胞苷酸[_(Bz)C~(Bz)(OB_z)p],与2′、3′-O-二乙酰基-N,N-二甲基鸟苷[m_2~2(OAc)_2]经DCC缩合,脱去保护基后可分离出胞苷酰-(3′→5′)-N,N-二甲基鸟苷(Cpm_2~2G)。(3)_(Bz)C~(Bz)(OBz)p与N-二甲基氨基甲叉鸟苷酸(G_P~(DMM)),用DCC缩合,脱保护基后可得到胞苷酰-(3′→5′)-鸟苷-2′,3′-环状磷酸(CpG>p)。(4)用RNase N_1(E.C.2.7.7.26)催化CpG>p与Cpm_2~2G反应生成26%产率的CpGpCpm_2~2G。经纯化后产物不含酶,用RNase N_1水解得到等克分子的CpGp CpG>p和Cpm_2~2G,碱解可分离出Cp(2′ 3′),Gp(2′ 3′)及m_2~2G,克分子比为2.07:1.0:1.1。     

多核苷酸合成的研究 Ⅺ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子中含N,N-二甲基鸟苷的四核苷三磷酸(CpGpCpm_2~2G)的合成

(1)参照已报道方法,从鸟苷合成了N,N-二甲基鸟苷(m_2~2G)。(2)N、2′、5′-O-三苯甲酰胞苷酸[_(Bz)C~(Bz)(OBz)p],与2′、3′-O-二乙酰基-N,N-二甲基鸟苷[m_2~2G(OAc)_2]经DCC 缩合,脱去保护基后可分离出胞苷酰-(3′→5′)-N,N-二甲基鸟苷(Cpm_2~2G)。(3)_(Bz)C~(Bz)(OBz)p 与N-二甲基氨基甲叉鸟苷酸(G_p~(DMM)),用DCC 缩合,脱保护基后可得到胞苷酰-(3′→5′)-鸟苷-2′,3′-环状磷酸(CpG>p)。(4)用RNase N_1(E.C.2.7.7.26)催化CpG>p 与Cpm_2~2G 反应生成26%产率的CpGpCpm_2~2G。经纯化后产物不含酶,用RNasc N_1水解得到等克分子的CpGp CpG>p 和Cpm_2~2G,碱解可分离出Cp(2′ 3′),Gp(2′ 3′)及m_2~2G,克分子比为2.07:1.0:1.1。     

甲基乙烯基醚和2′(3′)-0-甲氧乙基-5′-核糖核苷二磷酸的合成

本文报导了一种制备甲基乙烯基醚(MVE)的简易方法,其合成反应途径是: 在三氟乙酸催化作用下,MVE与各种5′-核苷二磷酸(ppN)反应,用纤维素柱层析方法分离反应产物,制备了五种2′(3′)-O-甲氧乙基-5′核苷二磷酸(ppN-2′(3′)-O-ME):ppA-2′(3′)-O-ME,ppG-2′(3′)-O-ME,ppC-2′(3′)-O-ME,ppU-2′(3′)-O-ME,以及ppΨ-2′(3′)-O-ME,产率一般为50～70%。     

脑啡肽基因的合成——Ⅱ.d-GGAAACCA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链26核苷酸中八核苷酸片段d-GGAAACCA(10～17)的合成。合成系采用改良的三酯法,先合成和,再用对氯苯基磷酰二氯在1,2,4-三氮唑存在下磷酰化得到和,然后由bzAobz开始,依次同和缩合得到。在所有的缩合反应中,缩合剂均采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑。所得的全保护八核苷酸用浓氨水和80%醋酸脱去保护基后再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25(7M尿素)柱层析分离纯化并去盐后,即得到d-GGAAACCA。产物经5'-~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳-同系层析双向图谱能够得到预期的核苷酸排列顺序。     

惊厥和抗癫痫药对中枢神经系统内环核苷酸的影响

3＇,5＇-环-磷酸腺苷(cAMP)是细胞内的一种“第二信使”,许多激素、神经递质等“第一信使”的作用均通过它实现。3＇,5＇-环-磷酸鸟苷(cGMP)也是一种“第二信使”;但对其生理功能的研究比cAMP少。近年来认为,以上两种环核苷酸(CN)在某些神经病中(包括癫痫)可能起着重要作用。许多实验材料证明,动物脑内的CN与惊厥,癫痫和抗癫痫药物的作用有密切关系。一、惊厥和癫痫对脑内环核苷酸的影响     

滇池水华蓝藻铜锈微囊藻和绿色微囊藻的生长生理特性及毒素分析

从滇池分离纯化了两种常见水华微囊藻即铜锈微囊藻和绿色微囊藻。在常规培养条件下,两种藻类在对数生长期的生长速率μ值分别为0.61和0.63;早期生长的抑制光强不大于100μmol m~(-2)s~(-1)。铜锈微囊藻主要产生3种微囊藻毒素:MYCST-RR,MYCST-YR和MYCST-LR,绿色微囊藻产生的主要微囊藻毒素为[Dha~7]-MYCST-RR,和[Dha~7]-MYCST-LR,另含有少量的[Dha~7]-MYCST-YR。在低光强15μE m~(-2)s~(-1)时,毒素含量每毫克干重细胞达到3.127μg微囊藻毒素,当光强达到100μE m~(-2)s~(-1)时,毒素含量降低到每毫克干重细胞1.971μg;光强对毒素形成的影响受到温度的调节,而温度对毒素形成的影响不大。探讨了两种微囊藻细胞在不同光照强度下叶绿素荧光比值Fv/Fm的变化,此比值的变化可以间接反映细胞受外界光照强度抑制程度。     

程序性坏死(Necroptosis)的分子机制

程序性坏死(Necroptosis)是一种不同于凋亡及传统坏死的细胞程序性死亡方式, 可由肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor, TNFR)或模式识别受体(Pattern recognition receptor, PRR)调控启动。受体相互作用蛋白(Receptor-interacting protein, RIP)1和3是启动necroptosis的两个关键蛋白, necroptosis启动后需要一系列分子传递和执行死亡信号, 如多核苷酸二磷酸-核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose) polymerase, PARP-1)、活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)、Ca²⁺等, 这些分子破坏线粒体及其他细胞器, 最终使细胞在缺乏天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的情况下死亡。Necroptosis细胞可将损伤相关模式分子(Damage-associated molecular patterns, DAMPs)暴露到细胞外, 被吞噬细胞识别并清除。文章对启动necroptosis的受体分子、传递执行细胞坏死的重要分子和坏死细胞的清除过程进行了概述。     

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证,为进一步SSR分子标记开发提供依据。对Hi Seq2000测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索,共获得45 706个SSR位点,出现频率为10.38%,平均4.30kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主,所占比例为56.47%;二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%;其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT;其次为3核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150对引物,通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证,其中有79对能获得扩增条带,21对引物扩增出单一条带,比例为14.0%。     

两种黄连转录组中SSR位点信息分析与多态性引物开发

本研究通过对两种黄连,即黄连(Coptis chinensis Franch.)和云南黄连(C.teeta Wall.)转录组中SSR位点信息的分析,设计SSR引物,为开发新的SSR标记提供理论基础。利用MISA工具筛选黄连及云南黄连转录组测序获得的55 903和49 741条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;Primer3设计SSR引物,随机选取60对引物对两种黄连,每种20株,共40株进行多态性扩增分析。黄连和云南黄连转录组分别搜索到4 071和4 041个SSR位点。两种黄连中二核苷酸和三核苷酸重复皆是主要的类型,分别占总SSR的87.71%和87.58%。黄连中,二核苷酸重复基元出现最多的为AG/CT,共953个,占总SSR的23.40%,三核苷酸重复基元出现最多的为AAG/CTT,共746个,占总SSR的18.3%;在云黄连中,AG/CT和AAG/CTT分别为934(23.10%)和773(19.10%)。随机选取60对引物进行PCR扩增,其中12对(20.00%)表现出多态性差异。利用Populations软件作图,将40个材料分为2类。两种黄连转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅰ.萤光试剂的制备和核苷二醛、5′-次甲基核苷二醛的萤光标记

本文报告了两种萤光试剂的制备方法并用一种萤光试剂标记了四种核苷二醛和四种5'-次甲基核苷二醛。萤光试剂Ⅰ,1-二甲氨基萘-5-磺酰-甘氨酰肼(DNS-Dly-NHNH_2)的制备方法:1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)与甘氨酸乙酯(Gly-OC_2H_5)反应,得1-二甲氨基萘-5-磺酰-甘氮酸乙酯(DNS-Gly-OC_2H_5),DNS-Gly-OC_2H_5经肼解得DNS-Gly-NHNH_2。萤光试剂Ⅱ,1-二甲氨基萘-5-磺酰肼(DNS-NHNH_2)的制备方法:1-二甲氨基萘-5-磺酰氯直接肼解得1-二甲氨基萘-5-磺酰肼(DNS-NHNH_2)。DNS-Gly-NHNH_2与腺苷二醛,鸟苷二醛,胞苷二醛以及尿苷二醛反应,分别得到四种萤光标记的核苷腙:DNS-Gly-_(HO)A_R,DNS-Gly-_(RO)G_R,DNS-Gly-_(HO)C_R,以及DNS-Gly-_(HO)U_R。DNS-Gly-NHNH_2与5'-次甲基腺苷二醛,5'-次甲基鸟苷二醛,5'-次甲基胞苷二醛以及5'-次甲基尿苷二醛反应,分别得到四种萤光标记的5'-次甲基核苷腙:DNS-Gly-_(H_2)A_R,DNS-Gly-_(H_2)G_R,DNS-Gly-_(H_2)C_R以及DNS-Gly—_(H_2)U_R。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅳ.寡核糖核苷酸3′-端的显色标记微量测定法

本文报告用甲基橙为原料合成了甲基橙的两种衍生物:4-二甲氨基偶氮苯-4'-磺酰-甘氨酰肼(DABS-Gly-NHNH_2,Ⅰ)和4-二甲氨基偶氮苯-4'-磺酰肼(DABS-NHNH_2,Ⅱ),并用(Ⅰ)成功地标记了高碘酸氧化的核苷二醛。标记产物在聚酰胺薄板上分离得很好,其灵敏度达到10~(-9)～10~(-10)克分子,比紫外吸收法灵敏数十倍。我们用试剂(Ⅰ)标记测定了四种不同的寡核糖核苷酸的3'-端,用量为0.08～0.12A_(260)。     

甲基乙烯基醚和2′(3′)-O-甲氧乙基-5′-核糖核苷二磷酸的合成

本文报导了一种制备甲基乙烯基醚(MVE)的简易方法,其合成反应途径是:(1) CH_3CHO+CH_3OH+HCl -20℃→CH_3OCH(Cl)CH_3+H_2O(2) CH_3OCH(Cl)CH_3+C_5H_5N -20°→[CH_3OCH(Cl)CH_3·C_5H_5N](3) [CH_3OCH(Cl)CH_9·C_5H_5N] -120°→CH_3OCH=CH_2+C_5H_5N·HCl 在三氟乙酸催化作用下,MVE与各种5’-核苷二磷酸(ppN)反应,用纤维素柱层析方法分离反应产物,制备了五种2’(3’)-O-甲氧乙基-5’-核苷二磷酸(ppN-2’(3’)-O-ME):ppA-2’(3’)-O-ME,ppG-2’(3’)-O-ME,ppC-2’(3’)-O-ME,ppU-2’(3’)-O-ME,以及ppΨ-2’(3’)-O-ME,产率一般为50～70%。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究——Ⅰ.萤光试剂的制备和核苷二醛、5′-次甲基核苷二醛的萤光标记

本文报告了两种萤光试剂的制备方法并用一种萤光试剂标记了四种核苷二醛和四种5′-次甲基核苷二醛。萤光试剂Ⅰ,1-二甲氨基萘-5-磺酰-甘氨酰肼(DNS-Gly-NHNH_2)的制备方法:1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)与甘氨酸乙酯(Gly-OC_2H_5)反应,得1-二甲氨基萘-5-磺酰-甘氨酸乙酯(DNS-Gly-OC_2H_5),DNS-Gly-OC_2H_5经肼解得DNS-Gly-NHNH_2。萤光试剂Ⅱ,1-二甲氨基萘-5-磺酰肼(DNs-NHNH_2)的制备方法:1-二甲氨基萘-5-磺酰氯直接肼解得1-二甲氨基萘-5-磺酰肼(DNs-NHNH_2)。DNs-GIy-NHNH_2与腺苷二醛,鸟苷二醛,胞苷二醛以及尿苷二醛反应,分别得到四种萤光标记的核苷腙:DNs-GlY-_(Ho)A_R,DNS-Gly-_(Ho)G_R,DNs-Gly-_(Ho)C_R,以及DNS-Gly-_(HO)U_R。DNS-Gly-NHNH_2与5′-次甲基腺苷二醛,5′-次甲基鸟苷二醛,5′-次甲基胞苷二醛以及5′-次甲基苷二醛反应,分别得到四种萤光标记的5′-次甲基核苷腙:DNS-Gly-_[H(?)]A_R,DNS-Gly-_[H(?)]G_R,DNS-Gly-_[H(?)]C_R 以及DNS-Gly-_[H(?)]U_R。     

广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物。CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp。以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT—PCR扩增。对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源。因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV。混合上述两种病毒的PCR引物,采用双重RT—PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49．7％)检出CyMV,52份(34．0％)检出ORSV,2份(1．3％)同时检出CyMV和ORSV。