重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ条件优化

通过考察pH、培养温度、溶解氧浓度和诱导时机对细胞生长和类人胶原蛋白Ⅱ表达的影响, 确定这些因素的最佳控制范围, 优化发酵条件。结果表明: 控制初始pH为6.5, 诱导后pH为6.8, 培养温度34°C, DO 20%及在对数生长后期进行诱导, 有利于细胞生长和外源基因的表达, 最终细胞密度为88.4 g/L, 类人胶原蛋白Ⅱ产量达到14.2 g/L。     

III型类人胶原蛋白在大肠杆菌重组表达及发酵制备

【背景】胶原蛋白广泛应用于日用化工及生物医药中,相比传统方法,基因工程方法制备胶原蛋白具有避免病毒隐患、产量高等优点,逐步受到广泛关注。【目的】获得III型类人胶原蛋白基因,实现大肠杆菌中的异源表达。【方法】以人III型胶原蛋白α1链为模板,(Gly-X-Y)为最小研究单位,优选亲水性氨基酸,设计目标基因kit,构建重组大肠杆菌(Escherichia coli) pET-28a(+)-kit/BL21(DE3),并对其结构进行表征。【结果】类人胶原蛋白基因kit成功在大肠杆菌体系中表达,表达量约为0.53 g/L,7 L发酵罐上补料发酵后其最大表达量提高至3.02 g/L,亲和层析纯化类人胶原蛋白纯度约为91%,对其进行N端测序、氨基酸分析、质谱分析及圆二色谱分析,确定类人胶原蛋白成功表达。【结论】类人胶原蛋白的成功表达为未来规模化制备及其在日用化工及生物医药行业的应用奠定了基础。     

甘油相控制策略对重组毕赤酵母表达瑞替普酶(reteplase)的影响

研究了甘油补料策略对毕赤酵母表达reteplase(rPA)的发酵过程中细胞的生长和rPA表达的影响。通过将对甘油补料速率由10g/L.h-1增大到20g/L.h-1,细胞比生长速率,甘油的比消耗速率,甘油得率等都得到极大提高。而且,诱导期细胞生长,甲醇消耗和rPA的生成速率都增加,rPA的最大表达量从140.2mg/L增加到199.5mg/L。此另外,甘油补料时间也是影响rPA表达的重要因素,甘油补料时间短,细胞密度小,表达rPA少,甘油补料时间长,细胞密度增大,rPA的表达速率也增加,但是到诱导后期,细胞死亡率增大,蛋白酶释放增加,rPA的降解增强。     

元素衡算和代谢衡算在类人胶原蛋白表达期的应用研究

应用元素衡算和代谢衡算方法,建立用重组大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白表达期的数学模型,并利用非线性优化法对模型中的未知参数进行估算。结果表明该模型与重组大肠杆菌的生长、代谢动力学模型一致,且模型的关键计算参数αh、αp和mx分别为1.173 molo C-mol-1、293.814 molo C-mol-1和17.878 molo C-mol-1oh-1。该模型能较好地预测重组类人胶原蛋白表达期中的宏观反应速率,且在类人胶原蛋白发酵表达期,必须通过控制葡萄糖的补料速率来控制菌体的生长,当?=0.04 h-1时,类人胶原蛋白的比生成速率达最大值。     

重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶

对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了试验,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料方式的研究。在摇瓶发酵时,最佳种龄为16h,接种量为3％,甲醇的诱导浓度为15g／L,生长阶段最适pH为5．0,诱导阶段最适pH为5．5。在间歇补料、恒速补料、变速补料三种补料方式中以变速流加最优。     

重组类人胶原蛋白工程菌补料发酵过程建模

对产类人胶原蛋白的重组大肠杆菌Escherichia coli(E. Coli) 的批式和分批-补料培养动力学进行了研究。通过检测发酵过程的基质浓度、菌体量和产物浓度,建立了一组反映发酵的动力学模型,并考虑了非工程菌存在的影响,分析了细胞生长、底物消耗、基因工程产物生成的过程,结果显示该动力学模型可以很好的拟合发酵过程。     

重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72～ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。     

重组大肠杆菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺研究

以表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了大肠杆菌工程菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺。通过测定细胞密度、细胞干重、分离菌体可溶性成分与不溶性成分及SDS-PAGE电泳,分析重组大肠杆菌的生长和普鲁兰酶的表达情况。摇瓶试验使用合成培养基和LB培养基,重组大肠杆菌在合成培养基生长较慢,诱导5 h的普鲁兰酶表达量高于LB培养基,包涵体比例低于LB培养基。重组大肠杆菌的高密度发酵使用合成培养基,补料阶段采用指数流加的工艺,在设定细胞的比生长速率为0.12的前提下,限制补料中碳源的供应,以阻止乙酸的产生。当细胞密度OD600达到70.0开始诱导,最终细胞密度为每升53.3 g细胞干重,细胞内可溶性普鲁兰酶为每升1.35 g。     

重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶分批补料发酵工艺

为了获得低成本的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL),在5L发酵罐发酵中对工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-TLL的分批补料发酵工艺进行研究。结果表明:以葡萄糖为碳源的补料培养基,采用溶氧(DO)反馈补料策略进行补料,当OD600=60时降温至28℃,分2次加入终质量浓度为30g/L乳糖进行诱导表达。优化后TLL的表达量提高到798.5U/L,是优化前的2.4倍。本研究为规模化发酵重组菌生产TLL奠定了基础。     

大肠杆菌BL21(DE3)磷酸转乙酰基酶缺陷变株的发酵研究

研究了E.coliBL21(DE3)及其磷酸转乙酰基酶(PTA)缺陷变株FR55发酵过程中菌体生长和有机酸产生情况,并以肿瘤坏死因子(TNF)为外源蛋白表达的模型考察了pta基因缺陷对外源蛋白表达的影响。在摇瓶培养条件下,pta变株TNF的表达水平比亲株提高了23%。在5L发酵罐中进行了补料分批培养试验,在不限制比生长速率的条件下pta变株能够以较长时间和较高比生长速率保持对数生长,最终达到32.5g(DCW)/L的菌密度,TNF的总表达量达2.8g/L;而在相同条件下,以BL21(DE3)为受体菌的对照组最高菌密度为19.5g(DCW)/L,TNF总表达量只有0.84g/L。表明pta变株对于提高工程菌外源蛋白的表达和实现高密度培养具有一定应用价值。分析了补料分批培养过程中发酵液有机酸组成和含量的动态变化情况,发现pta变株乙酸累积水平明显降低(为亲株乙酸累积水平的42%)的同时,其他几种有机酸(丙酮酸、乳酸、琥珀酸)的累积有显著增加的趋势,使发酵液中总有机酸浓度增加了123%,其中乳酸的累积是影响菌体进一步生长的主要因素。