急性早幼粒白血病HL60细胞电转染条件的优化

目的：比较不同电转染条件下,真核表达载体转染HL60细胞的效率,筛选得到针对HL60细胞最佳的电转染条件。方法：采用pDsRED-C1真核表达载体,分别在2mm和4mm电转杯中依照不同电转条件对HL60细胞进行转染,根据存活细胞所占比例确定电转参数;在转染48h后,比较不同质粒加入量及二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）加入电转体系前后的细胞转染阳性率。调整G418筛选浓度,在选定转染条件下进行HL60细胞电转,采用流式细胞技术,细胞化学染色及超微结构观察,分析电转前后HL60细胞的生物学性状。应用相同条件再转染eYFP-C1质粒于HL60细胞,G418筛选后观察荧光表达情况。结果：HL60细胞在2mm和4mm电转杯中的死亡数量随电击强度和脉冲次数的增加而升高,且方形波较回旋波有更强的击穿细胞膜的能力;固定电转参数下,2mm和4mm电转杯中的HL60细胞电转阳性细胞数随加入质粒量的增加呈先升高后下降的趋势,且在相同质粒加入量,2mm电转杯比4mm电转杯有更高的转染效率;在相同电转参数和相同电转杯中,预冷条件下加入DMSO电转时阳性率比不加入DMSO进行电转的阳性率高近13倍;400μg/ml G418是最佳筛选浓度;选定最佳电转条件进行电转,通过筛选,没有发现细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达,细胞形态原始,未见凋亡现象发生。相同条件电转eYFP-C1空载质粒于HL60细胞仍然可以获得很好的转染效果。结论：HL60细胞电转染条件的改良,可以有效提高HL60细胞的电转阳性率,为后续细胞真核表达载体的转染及基因功能研究奠定基础。     

不同电转仪的电转参数、质粒用量和拓扑结构对猪胎儿成纤维细胞转染效率的影响

为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)辅助优化NEPA 21和Nucleofector? 2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质粒用量和拓扑结构在ECM^? 830、NEPA 21和Nucleofector? 2b中的转染效率。结果显示：NEPA 21电转PFFs的最佳穿孔参数为脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,脉冲电压衰减幅度10%;Nucleofector? 2b在U-023的转染参数下达到最高转染效率。ECM^? 830和Nucleofector? 2b的最适质粒用量都为10 μg,而NEPA 21为8 μg;超螺旋质粒比线性化质粒的转染效率更高,且3种仪器中Nucleofector? 2b转染效果最佳。本研究综合考虑电转仪、电转参数、质粒用量和拓扑结构的影响因素以优化PFFs的电转条件,为高效制备转基因猪及基因编辑猪的研究奠定基础。     

融合蛋白基因与抗体基因电转染CHO-S细胞的条件摸索优化

旨在对编码融合蛋白和抗体的重组质粒转染CHO-S细胞的转染条件进行摸索优化,提高外源基因的转染效率,从而增加外源蛋白的表达。应用Amaxa Nucleofector-II电转仪,从电转染程序、质粒用量及细胞用量三方面着手,最终发现编码融合蛋白的重组质粒的最佳电转条件为:电转程序U-030,质粒用量20μg/孔,细胞用量1×10~7个/孔;编码抗体的重组质粒的最佳电转条件为:电转程序U-024,质粒用量15μg/孔,细胞用量1×10~7个/孔;实验结果进一步显示抗体重组质粒电转染CHO-S细胞的效果要优于融合蛋白重组质粒,利用高通量细胞筛选仪Clone Pix对转染后重组细胞的阳性克隆数进行统计,证实了该抗体重组质粒的转染效率更高。这为以后的抗体及融合蛋白重组质粒电转染CHO-S细胞提供了一定的数据支持,同时提示不同类型的细胞及外源基因,都需要设计相应的电转染实验进行条件优化,进而为获得高产稳定的生产用细胞株奠定基础。     

TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化

本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。     

超声微泡介导P53对宫颈癌HeLa细胞转染效率的试验研究

探讨超声微泡介导野生型P53质粒转染人宫颈癌HeLa细胞的最优参数及转染效率,为外源性基因的高效定向转移奠定基础,为宫颈癌的基因治疗提供一条新的思路.将培养的HeLa细胞分别给予超声时间10 s,30 s,60 s,超声强度0.5,0.75,1 W/cm2的组合辐照,以筛选出对HeLa细胞无明显抑制作用的参数组合,再在筛选出的条件下将P53转染入HeLa细胞,24～48 h后,用荧光显微镜观察转染情况.将优化的超声条件用于下步转染,试验分为5组,即空白对照组、质粒组、质粒+微泡组、质粒+超声组、质粒+微泡+超声组,用RT-PCR分析各组转染情况.结果显示:当超声条件为0.5 W/cm2,30 s时,P53在HeLa细胞的转染率较其他试验组高,差异具有统计学意义;超声联合微泡可促进野生型P53质粒转染宫颈癌HeLa细胞,单独超声辐照有较弱的促转染作用.因此,适当的微泡浓度在优化的超声条件下能有效的提高P53质粒在HeLa细胞中的转染效率.     

大质粒转染人源心室肌Ac16细胞条件探究

该研究主要针对大质粒转染人源心室肌Ac16细胞的方式及最适条件进行摸索。采用人源心室肌Ac16细胞作为研究模型,分别用Lip3000转染、核酸脂质体(Hieff Trans^TMLiposomal)转染和慢病毒转染三种方法将外源大质粒pLenti-CasRx-EGFP导入Ac16细胞中,通过统计表达绿色荧光蛋白的阳性细胞比例,分析外源基因的转染效率,探索大质粒pLenti-CasRx-EGFP的最佳转染方式和转染条件。结果表明,Lip3000转染Ac16细胞的最适转染条件为:质粒与Lip3000的比例为1:2;核酸脂质体转染Ac16细胞的最适条件为:质粒与脂质体的比例为1:3;慢病毒感染Ac16细胞的最适MOI值为200;通过比较三种转染方式的转染效率发现慢病毒的转染效率最高。最后得出大于10 Kb的大型质粒(pLenti-CasRx-EGFP)转染人源心室肌Ac16细胞最适合的方式是利用慢病毒转染,最佳MOI值为200。     

电转染哺乳类动物细胞DG44-CHO的方法探讨

目的：建立并验证DG44-CHO细胞快速、无血清培养体系的转染方法。方法：将绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1电转入DG44-CHO细胞,用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达量;将不同重组蛋白表达质粒C1—28／GL1／pCMV163、C1-28／GL2／pCMV163和TmHL／pCMV163分别电转入DGd4-CHO细胞,ELISA检测其培养上清中相应重组蛋白的表达。结果：280V电压电击20ms、质粒用量为20pg时,转染细胞中绿色荧光蛋白的表达量最高;同样在该条件下,培养上清中重组蛋白浓度最高。结论：上述电转染条件具有一定的适用性。     

Xfect介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3高效转染Vero细胞的方法及其条件的优化

旨在用Xfect试剂介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3转染Vero细胞,以期获得转染效率较高的方法,并检测目标片段的表达,从而为进一步研究HSV-2 LAT基因及其ORF3片段的生物学功能奠定基础。用Xfect试剂介导重组质粒pEGFP-C2/LAT-ORF3转染Vero细胞,48 h后观察荧光表达情况,并计算不同转染方法分别在有无血清及质粒与Xfect Polymer比例不同时的转染效率。用RT-PCR检测ORF3片段在Vero细胞中的表达。结果显示,采用贴壁转染法,在有血清及质粒与Xfect Polymer比例为5μg/2μL时转染效率较高;RT-PCR可以获得目的条带,证明ORF3片段在Vero细胞中得到表达。本试验获得的优化条件可以显著提高Xfect Polymer对Vero细胞的转染效率;以绿色荧光蛋白作为标签鉴定目的基因在细胞中表达的方法切实可行。     

活化/抑制CD59 对T 淋巴细胞增殖的影响

目的：研究活化/抑制CD59 分子对T 细胞增殖的影响。方法：Jurkat细胞分别电转入pSUPER-siCD59 质粒及用CD59 活化 抗体刺激。激光共聚焦显微镜下观察细胞的电转情况及CD59 分子在细胞膜上的分布及表达;MTT 比色法检测细胞的增殖。 Western blot检测CD59 分子表达及T细胞活化相关蛋白ZAP70磷酸化水平。结果：激光共聚焦显微镜下可见电转染细胞表达绿 色荧光,转染效率约为40%。转染pSUPER-siCD59 质粒后CD59荧光强度强度降低,CD59 分子均匀分布于细胞膜与正常Jurkat 细胞分布一致。抗体活化后CD59 在细胞膜成簇状分布。抗体活后细胞增殖速率和磷酸化ZAP70 的蛋白表达水平均高于正常组 （P<0.05）,而细胞电转质粒后则恰恰相反。结论：CD59 通过与信号转导分子的相互作用促进T 细胞活化增殖。     

活化／抑制CD59对T淋巴细胞增殖的影响

目的：研究活化／抑制cD59分子对T细胞增殖的影响。方法：Jurkat细胞分别电转入pSUPER-siCD59质粒及用CD59活化抗体刺激。激光共聚焦显微镜下观察细胞的电转情况及cD59分子在细胞膜上的分布及表达;MTT比色法检测细胞的增殖。Westernblot检测CD59分子表达及T细胞活化相关蛋白ZAP70磷酸化水平。结果：激光共聚焦显微镜下可见电转染细胞表达绿色荧光,转染效率约为40％。转染pSUPER-siCD59质粒后CD59荧光强度强度降低,CD59分子均匀分布于细胞膜与正常Jurkat细胞分布一致。抗体活化后CD59在细胞膜成簇状分布。抗体活后细胞增殖速率和磷酸化ZAP70的蛋白表达水平均高于正常组（P〈0．05）,而细胞电转质粒后则恰恰相反。结论：CD59通过与信号转导分子的相互作用促进T细胞活化增殖。     

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞电穿孔转染条件的建立和验证

目的筛选并验证RAW264. 7细胞中电穿孔转染TRIB3过表达质粒和TRIB3 siRNA的条件,建立适用于RAW264. 7细胞的最佳电穿孔转染方案。方法通过改变脉冲电压、脉冲时长和质粒浓度等条件,将载体为p CMV6-Entry的TRIB3过表达质粒和TRIB3 siRNA转入RAW264. 7细胞,24 h后相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,72 h后Western Blot法检测TRIB3蛋白表达以验证目的基因表达改变情况。结果 (1)以不同脉冲电压转染时,110和120 mV组细胞形态和存活率与对照组无差异,130和140 mV组悬浮细胞较多、细胞存活率显著低于对照组(P0. 01),120、130和140 mV组TRIB3蛋白表达显著增加(P0. 05);(2)以不同脉冲时长进行转染时,10和20 ms组细胞形态和存活率与对照组无差异,30 ms组细胞存活率显著低于对照组(P0. 01),20和30 ms组TRIB3蛋白表达显著增加(P0. 01);(3)以不同质粒浓度进行转染时,2和4μg组细胞形态和存活率与对照组无差异,6μg组细胞存活率低于对照组(P0. 05),4μg组TRIB3表达显著增加(P0. 01);(4)以120 mV、20 ms条件转染不同浓度TRIB3 siRNA时,各组细胞形态和存活率均与对照组无差异,10 nmol/L组TRIB3表达仅为对照组的0. 19倍(P 0. 01)。结论以120 mV、20 ms条件在RAW264. 7细胞中电穿孔转染TRIB3过表达质粒(每样本4μg)和TRIB3 siRNA(10 nmol/L),在保证较高的细胞存活率的同时能显著改变目的基因的蛋白表达水平,为后续RAW264. 7细胞中质粒转染相关的基础研究提供实验依据和借鉴。     

三种试剂转染293T细胞的效率及毒性比较

该文旨在比较不同的转染试剂介导两种荧光素酶报告基因转染人胚肾细胞293T的效果。采用脂质体转染试剂Lipofectamine~? 2000、非脂质体成分X-tremeGENE HP DNA和FuGENE~? HD转染试剂,选取不同配比的质粒DNA和转染试剂分别将含有绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)的质粒转入293T细胞中,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,锥虫蓝染色法检测细胞存活率。X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染293T细胞的效率最高,不管目的基因、质粒DNA和转染试剂的配比如何,其转染效率均显著高于脂质体转染试剂(P均0.05);在相同的质粒DNA和转染试剂比例下,FuGENE~? HD试剂介导GFP转染的效率显著高于脂质体试剂Lipofectamine~? 2000(P均0.05),但二者介导RFP转染的效率无显著性差异(P均0.05);在质粒DNA和转染试剂比为1?2时,X-tremeGENE HP DNA试剂转染GFP和RFP的效率均显著高于FuGENE~? HD试剂(P均0.05),当比例递变为1?4时,二者的转染效率无显著性差异(P均0.05)。随着转染试剂使用量的增多,Lipofectamine~? 2000和FuGENE~? HD试剂的转染效率明显升高,而X-tremeGENE HP DNA试剂的转染效率则下降。与转染GFP基因相比,三种试剂的转染效率均随着目的基因RFP片段的增大而显著降低(P均0.05)。在质粒DNA和转染试剂的比例相同的情况下,三种试剂转染后的存活率无显著性差异(P均0.05),但随着转染试剂用量的增加,三种试剂转染后的细胞存活率均显著降低(P均0.05)。目的基因大小与转染效率成反比,综合考虑转染试剂用量、转染效率和细胞活性,该研究认为X-tremeGENE HP DNA转染试剂效果最好。     

电穿孔介导小干扰RNA高效转染小鼠附植前胚胎

使用Cy3标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA)转染小鼠附植前胚胎,建立向小鼠附植前胚胎导入siRNA的电穿孔方法。通过控制透明带弱化程度、电压、脉冲时间和脉冲次数等条件,采用不同参数组合并结合使用不同介质作为电转缓冲液将Cy3标记的阴性对照siRNA转染小鼠附植前胚胎。在荧光倒置显微镜下,观察胚胎的存活率、siRNA转染率以及阳性转染存活胚胎的囊胚发育率。结果显示小鼠附植前胚胎在使用台氏液消化胚胎透明带10 s后,以opti-MEM作为电转缓冲液,电穿孔参数设置为30 V,1 ms,3次的条件下取得最佳转染效果。总之,电穿孔方法可实现siRNA简便、高效地转染小鼠附植前胚胎。     

不同日龄大鼠颈上交感神经节神经元电转染方法

目的 建立一种高效电转染不同日龄大鼠颈上交感神经节(superior cervical sympathetic ganglion,SCG)神经元细胞的方法.提高转染后细胞的成活率、转染效率和干扰效率.方法 用传统的及经改良的神经元培养液分别培养电转染后的7日龄、14日龄和40日龄SD大鼠SCG细胞,24 h后用台盼蓝染色方法观察并计算细胞成活率;通过改变质粒DNA和siRNA与转染液比例,优化转染条件,于转染24h后在共聚焦显微镜下观察并计算转染效率或干扰效率.结果 改良培养液可使14日龄以上SD大鼠SCG细胞转染后成活率达到75％以上,明显高于传统培养液转染后的成活率(P＜0.01),且结果稳定,细胞状态良好,能够满足后续实验研究的要求;优化转染条件后,DNA 的转染率及siRNA的干扰率显著提高,当DNA与转染液比例为1∶100(μg∶μL)时,细胞转染率最高;当siRNA与转染液比例为1∶50(μg∶ μL)时干扰率最高.结论 通过改良神经元培养液及优化转染条件,成功提高了电转染后细胞的成活率、转染效率和干扰效率,利用电转染方法可成功转染不同日龄SD大鼠SCG神经元.     

电穿孔法转染293T细胞条件的优化

为筛选电穿孔转染人胚肾293T细胞的最优条件,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆至启动子p CMV前,获得的重组质粒在不同电压、质粒浓度和电击次数条件下电穿孔转染293T细胞,继而在倒置荧光显微镜下观察转染细胞,根据EGFP表达情况评价转染效率。结果表明400 V电压、45 mg质粒电穿孔转染293T细胞2次时转染效率达到44%,与脂质体转染效率(51%)无统计学差异。     

电转染效率影响因素的探讨

目的:探讨影响电转染效率的因素。方法:将CHO细胞和DNA(携带标志基因的质粒)混和后进行电转染,观察电转染前孵育温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对细胞存活率和电转染效率影响。结果:孵育温度不影响细胞的存活率,而影响基因的转染效率;电转染前后低渗条件有利于电转染;延长电转染持续时间和频率而不加大电压有利于电转染;最好选用处于G2/M期的细胞进行电转染。结论:初步认为温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对细胞存活率和电转染效率有一定的影响。     

葡聚糖磁性纳米颗粒外加磁场对人树突状细胞基因转染效率的研究

目的研究葡聚糖磁性纳米颗粒（the dextran coated magnetic iron oxide nanoparticles,DMN）在外加钕一铁一硼稀土固定磁场的作用下对人树突状细胞转染效率以及安全性的影响。方法先通过磁力计对DMN进行分析;再将修饰有多聚赖氨酸（Poly-L—Lysine,PLL）的DMN携带绿色荧光蛋白pEGFP—Cl质粒报告基因,在钕-铁-硼稀土周定强磁场的作用下,体外转染人树突状细胞,用荧光显微镜直接观察和流式细胞仪检测来评价外加磁场对DMN作为人树突状细胞转染载体效率的影响;在转染后采用MTT比色法测定在磁场干预下的DMN对人树突状细胞增殖和功能的影响以了解其细胞毒性。结果DMN的核心直径〈30nm,具有明硅的超顺磁性,比饱和磁化强度也明显高于相同Fe3O4含量的普通磁块;DMN作为基因载体在外加磁场作用下,转染12h即可将报告基因转染至人树突状细胞内并成功表达,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光细胞,24h转染率可达到最高（约为27％）,转染效率较未加磁场组提高了2～4倍。而且转染后的人树突状细胞增殖活性及功能未因DMN外加磁场及其作用时间的长短而受到影响。结论超顺磁性的DMN在外加磁场作用下可以明显、安全、有效地提高对人树突状细胞的转染效率。     

HL-60细胞诱导分化过程中STIM1 siRNA干扰的电转染研究

目的：以感受器相互作用分子（STIMI）为报告基因优化悬浮培养的二甲基亚砜（DMSO）诱导分化的HL-60细胞的电穿孔转染条件。方法：通过控制电压、电容、电阻、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将靶向STIMI的siRNA转入悬浮培养的dHL-60细胞,用荧光显微镜观察转染率,蛋白免疫印记方法检测干扰效率。结果：适当提高电压能提高悬浮培养的dHL-60细胞的转染效率,细胞状态不同干扰效率有所差异,DMSO诱导4d的dHL-60细胞在电压295V、电容1180μF、电阻5000的条件下转入STIMI siRNA系列并得到最大干扰效率（约60％）。结论：针对dHL-60细胞这种比较特殊的细胞系来说,电穿孔转染法是一种较好的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对dHL-60细胞的SiRNA干扰效率。     

弓形虫基因缺陷虫株建立方法的初步研究

目的:应用电穿孔技术转染TgP24基因敲除转染质粒于弓形虫RH,探讨电穿孔技术的应用条件,以及TgP24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中筛选的最适条件.方法:设定所需的电穿孔参数、条件,如电压,电容,脉冲次数,电击杯的大小,电转染缓冲液,电穿孔后,将弓形虫悬浮液分别转移到长有不同贴壁细胞的培养瓶中,37℃,5%CO2(体积分数)的培养箱中培养,观察弓形虫的生长状况,并对不同电穿孔参数、条件下的弓形虫存活率进行比较.12hr后换成加有福来霉素的完全培养基中选择培养,不同时间观察虫体及细胞生长情况;在细胞中选择培养10天后,收集虫体,4℃下福来霉素处理7天,再回复到细胞内用选择培养基培养5天,收集虫体,腹腔注射昆明小鼠,大量收集弓形虫用于提取RNA进行RT-PCR.结果:优化电穿孔条件后的弓形虫存活率得到提高(P＜0.05);在选择浓度为5.0μg/ml-7.5μg/ml的福来霉素培养基中,筛选虫株采用L929细胞做为宿主细胞最为适合;RT-PCR结果显示L929细胞筛选基因敲除虫株的效果较好.结论:初步确定了弓形虫电穿孔技术的应用条件,以及Tg P24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中的最佳筛选条件;获得了较好的转染效率,为进一步研究弓形虫Tg P24基因敲除株的生物学特性打下了良好的基础.     

优化脂质体对肝癌细胞株HepG2细胞转染效率

摸索用Lipofectamine 2000(Lipo)转染质粒pEGFP-C1到肝癌细胞HepG2较为合适的转染条件。以HepG2细胞为研究对象,采用脂质体Lipofectamine 2000转染pEGFP-C1质粒,在24孔板先按每孔0.5μg固定pEGFP-C1质粒用量,摸索Lipo在1μL、1.5μL、2μL、2.5μL量上较为合适的用量,确定Lipo用量后,然后固定Lipo为1μL,摸索质粒用量0.5μg、1μg,确定脂质体与质粒的最佳比例。此外,对转染中培养基是否含血清,Lipofectamine 2000与pEGFP-C1质粒比例为1:0.5的基础上,扩大用量,即Lipofectamine 2000 2μL和pEGFP-C1质粒1μg,以及脂质体复合物孵育细胞时间进行优化。最后,采用荧光倒置显微镜观察细胞转染效率和方差分析及秩和检验的统计学方法进行统计分析。结果显示,pEGFP-C1质粒固定为0.5μg时,Lipo用量在1μL及1.5μL用量组转染效率最好,之后随着Lipo用量加大,转染效率下降;固定Lipo用量1μL,pEGFP-C1质粒0.5μg时转染效率最好(p0.05),比例不变,扩大Lipo和质粒用量,并不增加转染效率。转染后于3 h、6 h、8 h、12 h、24 h换成正常培养基培养,转染6 h后换液较好。此外,研究发现培养基是否含血清不影响转染效率。本研究表明在24孔板板中用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞时较为合适的转染条件为每孔1μL Lipofectamine 2000和0.5μg质粒,脂质体与质粒的最佳比例为2:1,血清不影响转染效率,用含血清培养基转染后6 h换液培养。