拟南芥FT基因原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化

FT基因是植物成花素,在植物的开花调控中起着重要作用。构建了用于原核表达的FT-eGFP表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达。从IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等方面进行了细致的分析,最终建立了FT-eGFP融合蛋白诱导表达的优化体系:当菌液OD600=0.6-1.0时,采用IPTG1.0mol/L,在28℃诱导表达6h。摸索和建立了利用HisTrapKit标签,经过镍柱纯化,纯化目的蛋白的技术体系,为进一步研究FT基因在植物开花调控中的应用奠定了基础。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

GST-Exendin-4在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

为了制备GST-Exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-Exendin-4为模板,通过PCR扩增出Exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Exendin-4.经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同浓度的IPTG和不同温度诱导下,经SDS-PAGE分析鉴定,表达出Mr约为30 kD的目的蛋白,灰度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的29.9%,超声裂解后的上清通过Sepharose 4B亲和层析纯化、透析、除盐及冷冻干燥得到高纯度的目的蛋白.本研究成功制备了高纯度的GST-Exendin-4融合蛋白,为下一步进行目的蛋白大规模的生产打下了良好的基础.     

GST-Smad4融合蛋白的表达与纯化

旨在原核表达Smad4基因,纯化获得GST-Smad4融合蛋白。以人表皮HaCaT细胞的cDNA为模板,利用PCR扩增含有BamH I和SalI酶切位点的Smad4基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-Smad4融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。结果显示,成功构建pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Smad4蛋白;经MagneGST particles纯化的GST-Smad4蛋白可被Smad4的抗体特异识别。纯化的GST-Smad4蛋白可用于后续的生物学研究。     

GST-Ets-1融合蛋白的表达与纯化

[目的]旨在原核表达Ets-1基因,纯化获得GST-Ets-1融合蛋白。[方法]以SD大鼠脑垂体cDNA为模板,利用PCR扩增含有Bam HI和Not I酶切位点的Ets-1基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化GST-Ets-1融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建pGEX-4T-1-Ets-1原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Ets-1蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Ets-1蛋白可被识别ETS-1的抗体特异识别。[结论]纯化的GST-Ets-1蛋白可用于后续的生物学研究。     

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。     

重组小鼠树突状细胞因子DCF1的原核表达和纯化

目的:克隆小鼠重组树突状细胞因子DCF1蛋白进行原核表达、纯化与鉴定.方法:采用PCR从小鼠脑cDNA克隆dcf1基因,构建DCF1原核表达重组质粒(pET30a-DCF1)并转化E.coli的BL21(DE3)菌株.IPTG诱导重组蛋白表达,并在变性条件下经Ni sepharose FF6亲和层析柱纯化,再通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果:成功克隆到大小为972bp的小鼠源dcf1基因片段并准确插入表达载体pET30a,0.1 mmol/L IPTG诱导转化菌2h可表达大量的DCF1蛋白,并可经Ni Sepharose FF6柱亲和层析得到高度纯化.结论:成功获得纯化的42kDa重组小鼠DCF1蛋白,为后续进行DCF1蛋白功能研究奠定了基础.     

S100A4原核表达载体的构建以及蛋白的表达和纯化

S100A4是S100蛋白家族的成员,在细胞的增殖、分化、损伤修复以及肿瘤细胞转移等方面发挥重要的调控作用.本研究将S100A4全长基因构建到pET28a原核表达载体上,利用大肠杆菌表达系统表达和纯化出高纯度的重组人S100A4.通过试验证明,重组人S100A4蛋白在体外可以有效地增强黑色素瘤细胞A375-S2的增殖.重组人S100A4原核表达与纯化方法的建立将促进其结构和生物学功能研究,并且对于S100蛋白家族其它蛋白的表达与纯化具有重要的参考意义.     

炭疽芽孢杆菌EA1蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组炭疽芽孢杆菌EA1蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽孢杆菌A16R疫苗株染色体中扩增编码EA1蛋白的eag基因序列,经过纯化、酶切后克隆到含有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-2中,构建重组载体pGEX-EA1;将空载体（作为对照）、重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果：构建了EA1蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化获得了EA1蛋白;Western印迹表明,此蛋白可与GST标签抗体反应。结论：在原核表达系统中表达并纯化得到EA1融合蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

Prokaryotic Expression and Purification of Soluble Maize Ac Transposase

Transposons are mobile genetic elements that are found in all eukaryotic and prokaryotic species studied to date. The Maize Activator (Ac) transposase recognizes and excises Ac and Dissociation (Ds) elements and mediates insertion elsewhere in the genome. Insertions of Ds can cause disruption in gene sequences and hence are important functional genomics tool for tagging and cloning of unknown gene sequences. The involvement of Ac transposase (AcTPase) in Ds movement is well documented; however, protein structure and function of AcTPase is poorly understood. To express the maize AcTPase in E. coli, Ac cDNA was synthesized with an N-terminal 6xHis tag and cloned in pTrcAc expression vector. The expression cassette was induced in Rosetta2 (DE3) E. coli lines. End-point RT-PCR confirmed the integrity of AcTPase mRNA during cell culture. Autoinducing cultures grown at 37 °C produced prominent partial AcTPase products of ~40 kDa and ~70 kDa. Trypsin digestion and mass spectrometry analyses confirmed AcTPase in both the eluted peptides. When the cultures were grown at 22–25 °C for 24 h the expected ~90 kDa AcTPase soluble product was detected. The successful expression of full length AcTPase in soluble form allows further investigation of its structure and function.     

人白血病抑制因子在原核细胞中的表达与纯化

研究证明人白血病抑制因子(hLIF)是一种对多种不同类型的细胞和组织具有重要功能的细胞因子,其独特的生物学特性使其被广泛应用。介绍了自制的具有生物活性的hLIF,将hLIF基因克隆到pET32a中,并利用硫氧还蛋白(Trx)作为融合配体,在大肠杆菌中成功表达可溶性融合蛋白Trx-hLIF。亲和层析纯化后利用SDS-PAGE和Western blot对纯化结果进行检验。利用肠激酶(EK酶)切割融合蛋白,释放hLIF,随后通过简单的阳离子交换得到纯度高达98.1%的hLIF4.75mg。小鼠M1髓系白血病细胞增殖分析测定纯化的rhLIF的功能与hLIF具有相似的生物活性,EC50为5ng/ml,对应的比活性为0.5×107 IU/mg。     

ASCT2胞外域ECL2原核可溶性表达条件的优化及其纯化

目的构建重组人ASCT2胞外域ECL2融合蛋白的原核表达载体,优化其在大肠埃希菌中可溶性表达的条件,并获得纯化的ECL2蛋白。方法以PCR方法扩增编码ECL2的DNA片段,插入至pET-41b载体中,构建ECL2的原核表达载体,转化至大肠埃希菌,优化可溶性表达条件,GSH—Agarose亲和层析纯化并鉴定,与MCF-7细胞结合活性的测定。结果免疫印迹显示,ECL2融合蛋白既表达于包涵体中,也能以可溶性形式表达。随IPTG浓度的增高,可溶性表达水平提高;培养温度为28℃和33℃时可溶性产物高于37℃;而随诱导时间的延长至12h以上,可溶性表达量下降。可溶性表达优化条件为：温度33℃、IPTG浓度0．4mmol／L、诱导时间4h。经亲和层析获得高纯度ECL2蛋白并具有与MCF-7细胞结合活性。结论优化了ECL2融合蛋白的可溶性表达条件,通过亲和层析一步法可获得高纯度融合蛋白。     

UHRF2结构域突变体的原核表达与纯化

目的构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定。方法以pCMV-3xFlag—UHRF2为模板,PCR扩增UHRF2的各个结构域基因片段,各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上;将重组载体转化大肠埃希菌（BL21菌株）,IPTG诱导表达各GST融合蛋白,超声波破碎细菌,离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（glutathione sepharose 4B）亲合纯化;纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况。结果成功构建了UHRF2结构域突变体的原核表达载体,各突变体蛋白表达正确。结论UHRF2各结构域突变体的成功构建便于用GST pull—down实验研究UHRF2参与与其它蛋白相互作用的结构域,为了解UHRF2功能打下了基础。     

斑马鱼SFPQ蛋白的原核表达及纯化

Splicing Factor Proline and Glutamine Rich简称为SFPQ,是广泛表达在脊椎动物中的一类蛋白。它作为抑癌基因,对生物体内肿瘤发生具有重要的调控作用。目前对于SFPQ的研究主要集中在人和小鼠上,对于斑马鱼SFPQ的研究还比较少。为了获得原核表达的SFPQ蛋白进行下一步研究,构建了斑马鱼SFPQ-p ET28a重组质粒,然后转化到BL21化学感受态细胞中,探索用IPTG进行低温诱导蛋白的最适条件,然后用Ni-NTA琼脂糖镍柱纯化SFPQ蛋白。实验结果表明,当IPTG浓度为0.75 mmol/L,诱导时间为10 h时,蛋白表达量最大,Western blot结果表明纯化得到的斑马鱼SFPQ蛋白可以和抗体特异性结合,说明纯化得到的斑马鱼SFPQ蛋白可以用于下一步实验。     

结核分枝杆菌HspX蛋白的原核高效可溶性表达及产物抗原性分析

目的:利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌HspX蛋白并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增HspX核酸序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western印迹初步评价HspX的抗原性。结果:经IPTG诱导,HspX蛋白在原核系统内获得了可溶性表达,经镍柱亲和层析获得了纯度达95%以上的重组蛋白。Western印迹结果证明重组HspX蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论:重组蛋白HspX在大肠杆菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

LSECtin-CRD-GST融合蛋白的原核表达、纯化及复性

目的:构建C型凝集素LSECtin主要功能结构域CRD的原核表达载体,在大肠杆菌中表达LSECtin-CRD-GST融合蛋白。方法:根据Gen Bank发布的LSECtin基因序列设计引物,利用基因重组技术将获得的LSECtin-CRDc DNA定向克隆至C端带GST蛋白标签序列的融合表达载体p GEX-6p-1中,转化大肠杆菌Origami(DE3)进行重组蛋白的诱导表达,用GST柱亲和纯化融合蛋白。结果:获得了原核表达载体p GEX-6p-1-LSECtin-CRD,诱导表达出大量相对分子质量约40×103的包涵体融合蛋白,经纯化、复性获得可溶蛋白,经Western印迹鉴定为目的蛋白。结论:获得足量的LSECtin-CRD-GST融合蛋白,为进一步研究CRD蛋白结构域的动态构象变化提供了实验材料。     

生物活性肽Lunasin 的原核表达和分离纯化

目的:利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法:将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果:①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论:在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.