大腹园蛛管状腺丝重组蛋白的克隆表达及纺丝

TuSp1蛋白(tubuliform spidroin 1)是管状腺丝(tubuliform silkfiber)的主要组成成分。管状腺丝作为蛛丝卵袋的外层包卵丝,其结构具有很好的耐腐蚀性和良好的力学性能。目前国内外对大腹园蛛TuSp1蛋白的研究很少,仅有一条基因序列的报道。本课题首次构建含大腹园蛛N端非重复结构域、重复单元以及C端非重复结构域的重组管状腺丝蛋白TuSp1 NT-Rp-CT,并经湿法纺丝获得重组蛋白丝纤维。重组蛋白液圆二色谱分析结果显示,pH由7.0降低到5.5的过程中,始终保持稳定的α-螺旋构象;重组蛋白丝纤维的傅里叶变换红外光谱结果显示,丝纤维中主要二级结构为β-折叠及β-转角;经扫描电镜观察发现,冻干的絮状重组蛋白能自组装成丝纤维,且表面光滑纤细;湿纺后的重组蛋白丝纤维直径较粗,但表面较平整均匀,具有类似天然管状腺丝的形态特征,这些为TuSp1蛋白的成丝机理及仿生纺丝研究提供了理论依据。     

重组杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT的二级结构表征

重组蛛丝纤维作为一种性能优异的生物材料,具有良好的生物相容性,在生物医学工程领域具有极大的潜在应用价值。已有研究表明,重组蛛丝蛋白可用作血管、神经导管及药物载体等,但其生物学功能仍有待研究。本研究以大腹园蛛基因组为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得大腹园蛛梨状腺丝（piriform spidroin: PySp）一个完整重复区（Rp）编码序列;此Rp模块与MiSpNT/CT模块重组,构建微小型杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,成功在大肠杆菌BL21中高效表达,借助8 mol/L尿素裂解缓冲液进行变性纯化,得到纯度较高的杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,产量约100 mg/L。CD图谱显示,MiSpNT-PySpRp-MiSpCT蛋白质溶液主要以α-螺旋和无规卷曲形式存在,随着溶液pH值降低,部分α-螺旋向β-折叠转变;红外光谱显示,在自然成丝及冻干过程中,部分α-螺旋转化为β-折叠,符合天然蛛丝蛋白成丝过程的二级结构变化特征。本研究结果为今后获得具有天然蛛丝纤维优异性能的人工重组蛛丝纤维材料提供一种新的可能。     

盐离子对次壶腹腺丝蛋白重组模块的影响

为研究不同生理环境对蛛丝蛋白组装及成丝的影响,首次以MiSp序列为对象,研究其NTR1SR2CT重组模块在不同种类(浓度)盐离子条件下的聚集和成纤维特性及其在成纤维过程中二级结构的变化。基于大腹园蛛MiSp全长序列构建NTR1SR2CT模块,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功表达。借助8 mol/L尿素裂解包涵体进行变性纯化得到NTR1SR2CT重组蛋白。NTR1SR2CT重组蛋白二级结构主要为无规则卷曲(Random coil)或α螺旋(Helix),在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β折叠(β-sheet),甲醇能促进该转变过程。另外,钾离子和磷酸根离子有利于NTR1SR2CT重组蛋白聚集从而促进丝纤维的形成。研究结果为成丝机理研究奠定了基础,同时也为工业化生产高品质的蛛丝纤维提供了条件。     

三种类型蜘蛛丝的结构及生物学功能

利用付里叶变换红外光谱仪(FFIR)对棒络新妇(Nephila clavata)、悦目金蛛(Argiope amoena)的大壶状腺丝(拖丝)、悦目金蛛的捕丝(粘性螺旋丝)和卵袋丝这3种不同类型蜘蛛丝的二级结构进行了测试研究。结果表明：蜘蛛丝同时包含无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠构象;对这3种蛛丝的红外光谱进行比较表明同一蜘蛛的不同类型蛛丝所含的这3种二级结构的比例不同,这种不同组成的二级结构就赋予了蜘蛛丝不同的特性,这种特性又与其不同的功能相适应。此外,还用扫描电镜(SEM)和光学显微镜对悦目金蛛和小悦目金蛛(A．minuta)的拖丝和捕丝做了形态结构观察。蜘蛛丝这种天然动物蛋白纤维所具有的特殊的形态结构、蛋白质二级结构与其特殊的性能和生物学功能是高度一致的。     

蜘蛛丝蛋白研究进展

由于蜘蛛丝蛋白分子高度重复的一级结构、特殊的溶解特性和分子折叠行为以及具有形成非凡力学特性丝纤维的能力而引人注目。本文从蛛丝蛋白基因、天然蛛丝形成过程、蛛丝蛋白的基因工程生产及蛛丝蛋白的应用前景等几个方面着重介绍了近20年来对蛛丝蛋白的研究进展。围绕蛛丝蛋白展开的研究将有助于揭示蛋白质一级结构、蛋白质分子折叠与蛋白质大分子特性之间的内在联系。     

蛋白质内含子介导蛛丝功能化平台的建立

为建立高效快捷的蛛丝功能化修饰平台,蛋白质内含子的反式剪接技术被首次应用于重组蛛丝的功能化修饰。在体外通过Ssp Dna B的反式剪接作用,在蛋白质水平上将12 k Da泛素相关修饰蛋白(SUMO)与蛛丝蛋白(W2CT)连接形成功能化蛛丝蛋白SUMOW2CT。修饰后SUMOW2CT与W2CT均能形成纳米至微米级的丝纤维,但SUMOW2CT自动成丝速度明显下降且产量约为W2CT的一半。与W2CT丝纤维(W)相似,SUMOW2CT丝纤维(UW)不具有超收缩能力和对2%SDS不耐受,但机械性能低于W2CT丝纤维。功能化蛋白SUMOW2CT形成的丝纤维中SUMO蛋白仍保持着正确三维结构,可被SUMO蛋白酶酶切。外源功能化蛋白质虽在一定程度上降低了丝的形成速度和机械性能,但修饰上的功能化蛋白仍保持着生物活性,表明断裂蛋白质内含子介导的蛛丝修饰平台成功建立,也为蛛丝的功能化修饰和应用奠定了坚实的技术基础。     

蛛丝蛋白MiSp重组模块R1R2CT表达及其纤维化动力学研究

为探索蛛丝蛋白模块单元在成丝过程中的作用,研究了大腹园蛛Mi Sp R1R2CT功能模块在不同p H条件下的纤维化动力学特性。大腹园蛛Mi Sp蛋白的R1R2CT功能模块与硫氧还蛋白融合,并在BL21(DE3)中进行表达,表达量约为15 mg/L LB培养基。R1R2CT蛋白在p H 7.5和6.5时较为稳定,在22 h之内不发生纤维化;当p H值降至5.5时,R1R2CT在前2 h内快速纤维化,3~5 h趋势较为平缓;5 h之后R1R2CT蛋白再次出现Th T信号的快速增长,7 h后保持缓慢增长至22 h。R1R2CT的增长速率及幅度高于单独的CT(C-terminal)蛋白,而单独的R1R2在p H 7.5、6.5和5.5时均保持稳定,表明重复区依赖CT模块的快速纤维化模式。已有研究表明,CT在重复区纤维化过程中起晶核作用,该成果也从反面证实CT的晶核理论。     

主要壶腹腺丝蛋白分子结构与机械性能之间的关系

蜘蛛丝是性能优异的天然丝类材料,其中主要壶腹腺丝蛋白产生的牵引丝具有极高的力学性能、良好的生物相容性和生物可降解性,广泛应用于纺织、生物医学和环境工程等领域。深入研究蜘蛛丝蛋白分子结构与机械性能,有助于理解蜘蛛丝蛋白的成丝机制,为制备具有良好机械性能的人造蜘蛛丝纤维提供理论依据。该文围绕不同物种主要壶腹腺丝蛋白的分子组成、成丝机理和分子结构与机械性能之间的关系进行了阐述。     

大腹园蛛主壶腹腺蛛丝蛋白末端结构域的克隆表达

牵引丝(dragline silk)由主壶腹腺蛛丝蛋白(major ampullate spidroin, MaSp)组成,是蜘蛛丝中强度最好的丝,同时具有极佳的生物相容性和可降解性,因此引起研究者的研究热潮。目前关于大腹园蛛MaSp结构和成丝机理方面的研究甚少,限制了其仿生应用。本文以大腹园蛛牵引丝的组成蛋白质之一MaSp1为研究对象,通过锚定PCR的方法首次获取了大腹园蛛MaSp1 NT的完整编码基因,并对其进行了克隆、表达、纯化,产量可达60 mg/L;同时对该MaSp1的CT进行表达纯化,产量可达80 mg/L。另外,通过CD色谱分析了MaSp1 NT和CT的二级结构,结果表明二者的二级结构均以α-螺旋为主。上述结果为大腹园蛛MaSp1的结构和成丝机理研究奠定了基础。     

重组蜘蛛丝蛋白MiSp NT结构域在不同pH环境下的Trp荧光光谱及圆二色谱分析

为明确蛛丝蛋白NT结构域的生物学功能,首次研究了MiSp NT结构域在不同pH条件下的二聚化动力学及二级结构特性. 基于蛛丝蛋白MiSp全长编码基因,克隆并分别在BL21(DE3)和Rosetta-gami 2(DE3)中重组表达MiSp NT结构域: BL21(DE3)表达水平较高,约35 mg/L LB培养基,表达产物需经短暂超声和2 mol/L尿素促溶;Rosetta-gami 2(DE3)表达产物可溶性较好,但表达水平仅为BL21 (DE3) 一半左右. 融合蛋白经凝血酶介导的2次Ni-NTA纯化,纯度达到95%以上. Trp 荧光光谱分析表明,MiSpNT在pH为7.0左右时开始二聚化,pH5.7时二聚体为主要构象,pH_T约为6.6. MiSp NT在pH 7.5,6.5和5.5条件下的CD图谱相似,均主要为α-helix,表明NT二聚化与二级结构水平的变化没有直接联系. 本研究为进一步探索蛛丝蛋白NT结构域的结构和功能以及成丝机理提供线索.