脂质体介导法转染肿瘤细胞效率的优化

目的:研究优化影响脂质体转染效率的因素,以提高脂质体转染效率,为相关研究和应用提供参考.方法:以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine 2000包裹pU6H1-GFP-FAK重组质粒转染Caco-2细胞,研究了细胞接种密度、DNA用量、脂质体与DNA的比例、脂质体-DNA复合物的形成时间、细胞与脂质体复合物的孵育时间、血清的有无及细胞的传代次数等因素对脂质体转染效率的影响.结果:2-5次细胞传代,2×105接种密度、4μg DNA用量、2.5:1的脂质体与DNA比例、30min脂质体-DNA复合物形成时间以及6h细胞与复合物孵育时间,转染效率最高.血清在本实验室条件下并不影响转染效率.结论:实验获得的优化条件可以明显提高脂质体对肿瘤细胞的转染效率,可作为有关研究或应用的参考.     

大质粒转染人源心室肌Ac16细胞条件探究

该研究主要针对大质粒转染人源心室肌Ac16细胞的方式及最适条件进行摸索。采用人源心室肌Ac16细胞作为研究模型,分别用Lip3000转染、核酸脂质体(Hieff Trans^TMLiposomal)转染和慢病毒转染三种方法将外源大质粒pLenti-CasRx-EGFP导入Ac16细胞中,通过统计表达绿色荧光蛋白的阳性细胞比例,分析外源基因的转染效率,探索大质粒pLenti-CasRx-EGFP的最佳转染方式和转染条件。结果表明,Lip3000转染Ac16细胞的最适转染条件为:质粒与Lip3000的比例为1:2;核酸脂质体转染Ac16细胞的最适条件为:质粒与脂质体的比例为1:3;慢病毒感染Ac16细胞的最适MOI值为200;通过比较三种转染方式的转染效率发现慢病毒的转染效率最高。最后得出大于10 Kb的大型质粒(pLenti-CasRx-EGFP)转染人源心室肌Ac16细胞最适合的方式是利用慢病毒转染,最佳MOI值为200。     

多聚赖氨酸在悬浮细胞转染中的应用

目的:悬浮细胞的转染较贴壁细胞存在一定难度,用多聚赖氨酸包被的细胞培养板培养悬浮细胞使其贴壁,用脂质体2000按照贴壁细胞转染的方法转染悬浮细胞,提供一种高效的转染悬浮细胞的方法。方法:悬浮细胞Jurkat或CCRF-CEM培养于包被了0.1 mg/mL多聚赖氨酸的细胞培养板,16 h后洗掉未贴壁的细胞,用脂质体2000分别将pWPXLd质粒或靶向人ABL1基因的小干扰RNA(siRNA)转染细胞,24 h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白印迹鉴定siRNA的干扰效率。结果:pWPXLd成功转染2种细胞,siRNA成功抑制了ABL1的表达。结论:质粒和siRNA均能成功转染,提供了一种高效可行的转染悬浮细胞的方法。     

pEGFP-ORF2质粒在Vero细胞中的有效表达

目的：确立pEGFP—ORF2质粒在不同细胞密度,不同转染时间,及血清存在与否时在细胞中的有效表达,为进一步研究HSV-2LATORF2对细胞的作用,及阐明HSV-2潜伏复发机制打下基础。方法：采用脂质体法将pEGFP—ORF2与pEGFP—C2两个真核表达载体转染Vero细胞,观察荧光蛋白表达。结果：有无血清对转染效果无明显差异。在细胞密度为4．0×10^4cells／ml,转染后84hEGFP表达量较其它条件下高,且在相同条件下pEGFP—ORF2与pEGFP—C2的表达无明显差异。结论：血清对表达效果的影响不大,细胞的接种密度及转染时间对转染有明显作用,以荧光蛋白作为标签鉴定蛋白表达的方法切实可行。     

电穿孔法转染293T细胞条件的优化

为筛选电穿孔转染人胚肾293T细胞的最优条件,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆至启动子p CMV前,获得的重组质粒在不同电压、质粒浓度和电击次数条件下电穿孔转染293T细胞,继而在倒置荧光显微镜下观察转染细胞,根据EGFP表达情况评价转染效率。结果表明400 V电压、45 mg质粒电穿孔转染293T细胞2次时转染效率达到44%,与脂质体转染效率(51%)无统计学差异。     

CHO细胞高密度流加工艺参数优化

[目的]优化细胞接种密度、培养基、细胞培养温度等参数,提高生产细胞株PCSK9蛋白表达滴度。[方法]试验分四步进行,(1)探讨几款市售培养基优化组合后对CHO细胞株蛋白表达滴度的影响;(2)探讨10.0×10⁶、15.0×10⁶、50.0×10⁶ cells/mL高密度接种流加过程培养基、降温时间等对CHO细胞蛋白滴度的影响;(3)在(2)实验数据基础上继续优化,通过更换培养基继续探讨高密度流加工艺的可行性;(4)在反应器对实验数据进行工艺验证。[结果](1)CHO细胞PCSK9蛋白滴度提升至2.6 g/L,蛋白滴度成倍增长;(2)15.0×10⁶ cells/mL接种,30.0×10⁶ cells/mL降温至34℃,继续优化培养基1^#、2^#配比,蛋白滴度提升至4.5 g/L,反应器工艺验证,细胞生长状态稳定,蛋白滴度突破3.8 g/L;(3)继续筛选市售培养基,成功实现80.0×10⁶ cells/mL高密度流...     

第三代慢病毒高效率包装系统的建立

慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一,高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键.本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的第3代慢病毒载体系统,用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T包装细胞,培养48～72 h收集病毒上清液,通过超速离心进行浓缩,采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度.结果显示,用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T细胞,经检测病毒滴度达到5×108IU/mL以上,初步建成了高滴度慢病毒包装平台,为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础.     

小鼠精原干细胞不同转染方法效率的比较

本研究采用腺病毒感染、慢病毒感染、脂质体转染和电穿孔转化方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）的质粒转入经过差异贴壁法初步分离纯化的小鼠精原干细胞(SSCs)中,转染48 h后通过流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例比较4种方法在体外转染精原干细胞的效率.结果显示,脂质体转染效率最高仅为8.64%,不能满足对精原干细胞进一步实验的要求;电穿孔法效率最高达到25.27%,但转化后细胞大量死亡;腺病毒转染细胞的效率达到了32.4%;慢病毒转染效率最高,达到74.25%. 因此,慢病毒转染法是体外转染小鼠精原干细胞的有效方法.     

阳离子脂质体转染人类骨骼肌原代细胞的初步研究

探讨不同脂质体介导基因转染人类骨骼肌原代细胞的转染效率和基因的表达.将含有β-半乳糖苷酶LacZ结构基因的质粒,用三种不同的阳离子脂质体导入人类骨骼肌原代细胞中,通过X-Gal染色观察不同的转染效率.结果发现,Fugene 6转染效率最高,蓝染细胞达10%,其脂质体与DNA的最佳比例为3∶ 2.Fugene 6可有效地将外源基因导入骨骼肌原代细胞,而且外源基因可以长效高效地表达,有望用来作为基因治疗的载体.