小麦黄花叶病毒低分子量RNA1的鉴定

利用小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)潢川分离物连续继代机械接种感病小麦品种鄂恩1号,经继代接种12 代以上的小麦症状明显加重, Northern blot 检测发现一条明显的低分子量病毒RNA1(LMW RNA1),并在随后至26代的继代接种发病材料中稳定存在,但在利用同样病叶提纯的病毒粒子内检测不到LMW RNA1,表明其不能被包装到病毒粒子内。序列分析结果表明,低分子量RNA1 由病毒RNA1 发生内部缺失而产生,从RNA1 5′端非编码区(第68nt)到CI基因编码区的3′端(第2448nt)共缺失2380 个核苷酸,在缺失区域两端的结合位点存在六个碱基的正向重复序列CGTCTC。据此对此低分子量RNA1 的缺失机制进行了讨论,认为由一种模板转换机制导致了缺失的发生。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV-Xb)RNA3 cDNA的克隆和序列分析

通过RT-PCR方法,设计两对引物,克隆了黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV-Xb)RNA3,并进行了核苷酸和蛋白质水平上的分析.结果表明Xb株系RNA3全长2205nt,具有两个蛋白编码阅读框架(ORF),其中5'端(97～936nt)编码一个279aa的3a蛋白;3'端(1225～1871nt)编码一个218aa的CP蛋白.5'非编码区域为96nt;基因间隔区(IR)长288nt;3'NR含有324nt.通过与亚组Ⅱ其它株系RNA3核苷酸和所编码产物推导的氨基酸序列分析发现,亚组Ⅱ株系无论在编码区还是非编码区的核苷酸同源性都相对较高;亚组Ⅱ株系在进化过程中具有连续性.     

貂肠炎病毒的核苷酸序列和基因组结构

本试验测定了已克隆的貂肠炎病毒(MEV)复制型(RF)DNA的核苷酸序列,确定MEV基因组全长约为5064个核苷酸(nucleotides,nt),推测了3'端和5'端结构,在5'端非编码区有3个51 nt的重复。MEV基因组序列与犬细小病毒(CPV)、猫细小病毒(FPV)有很高的同源性,结构基因区的同源性分别达99.1%和99.9%,但在5'端非编码区有较大差异。MEV基因组结构与CPV和FPV基本一致,有两个大的开放阅读框架,分别编码688和722个氨基酸。在map unit(m.u.)3.7和m.u.39处有两个启动子,在m.u.97处有poly A位点。NS2、VP1和VP2的mRNA都发生剪接。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系（CMV—Xb）RNA3cDNA的克隆和序列分析

通过PR－PCR方法,设计两对引物,克隆了黄瓜花叶病毒香蕉株系（CMV-Xb)RNA3,并进行了核苷酸和蛋白质水平上的分析,结果表明Xb株系RNA3全长2205nt,具有两个蛋白编码阅读框型架（ORF）,其中5'端（97－936nt)编码一个279aa的3a蛋白;3'端（1225－1871nt)编码一个2188aa的CP蛋白。5'非编码域为96nt;其因间隔区（IR）长288nt;3'NR含有324nt。通过与亚组Ⅱ其它株系RNA3核苷酸和所编码产物推导的氨基酸序列分析发现,亚组Ⅱ株系无论在编码区还是非编码区的核苷酸同源性都相对较高;亚组Ⅱ株系在进化过程中具有连续性。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法:以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5'端20nt和43nt的HCV 5'NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5'NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCNl-d1、pCNl-d2).以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性(P＞0.05);pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0.05).结论:HCV 5NCR的5'端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMV-CA)株系进行克隆和序列分析.CMV-CA RNA1全长3 356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa 的1a 蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa 的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP).序列同源性比较表明,CMV-CA RNA1、2、3与CMV亚组IA CMV-Fny、亚组IB CMV-SD、亚组II CMV-Q 株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV) RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%.上述研究未发现CMV-CA基因组与PSV RNA链的重组,CMV-CA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA3 5′NTR结构分析以及RNA3 5′NTR和 CP 系统进化树分析表明,CMV-CA属CMV IB亚组.     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMVCA)株系进行克隆和序列分析。CMVCARNA1全长3356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa的1a蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP)。序列同源性比较表明,CMVCARNA1、2、3与CMV亚组IACMVFny、亚组IBCMVSD、亚组IICMVQ株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanutstuntvirus,PSV)RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%。上述研究未发现CMVCA基因组与PSVRNA链的重组,CMVCA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA35′NTR结构分析以及RNA35′NTR和CP系统进化树分析表明,CMVCA属CMVIB亚组。     

猪水泡病病毒HK'1/70株基因组全长cDNA的构建及其序列测定

从实验感染猪水泡病病毒(SVDV)的乳鼠组织中提取RNA,利用长距离的RACE技术,扩增出覆盖SVDV HK'1/70株全基因组的2个忠实性的cDNA重叠片段(3'PCR片段和5'PCR片段),分别克隆进pGEM-T Easy载体.利用AatⅡ和BssHⅡ酶切含5'PCR片段的重组质粒,回收目的片段,定向克隆于含3'PCR片段的重组质粒,构建出了SVDV HK'1/70株全长cDNA重组质粒,然后进行序列测定.结果表明,HK'1/70株基因组全基因组序列长7 401 nt(poly A除外),其中5'NCR长743 nt,该毒株蛋白编码区的核苷酸序列为6 558 nt,编码一个长2 185个氨基酸的聚合蛋白,3'NCR长102 nt,其后是至少含有74个A碱基的poly A尾.在HK'1/70株全长cDNA序列的5'端引入了T7启动子序列,在poly A 3'端引入了Psp1406Ⅰ识别序列.通过序列同源性和进化树分析,结果表明,HK'1/70属于第Ⅱ抗原遗传群,SVDV与CB5的遗传关系最近,且位于CB5遗传进化树的分支上.HK'1/70株全长cDNA的序列测定及构建,为拯救SVDV和在分子水平进一步深入研究SVDV打下坚实的基础.     

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶ d型新城疫病毒基因组末端序列及分析

[目的]简化cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,fLAcE)流程,测定基因Ⅲ、VIb)和VIId型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析.[方法]利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和eDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增.[结果]建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV 3'末端leader和5'末端trailer序列比对分析.[结论]本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5'端trailer与3'端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因Ⅲ型和VI型NDV均未发现该突变.通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3'末端形成一个发卡结构.JS/7/05/Ch等3株NDV U→C(T→C)的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3'-UCUC-5',与基因组3'端发卡环的3'-UCUUA-5'相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度.     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5'RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5'端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector.扩增片段的序列测定结果表明所分离的4株SARS-CoV基因组5'端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大.同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5'-CUAAAC-3'.     

8个小麦育种亲本抗叶锈基因分析

选取19个小麦叶锈菌生理小种对8个小麦育种亲本进行成株期和苗期抗叶锈病鉴定及基因推导,同时利用与24个抗叶锈基因紧密连锁或共分离的31个分子标记进行分子检测。推测出L83#-5与L83#-6含有Lr1,可能含有Lr2c和Lr42;L/PL2003-1含有Lr1,可能含有Lr2c、Lr28和Lr42;贵农13号可能含有Lr28;92R137可能含有Lr2c和Lr28;L201含有Lr1,可能含有Lr2c、Lr16和Lr28;TM可能含有Lr41和其他抗叶锈基因。研究结果表明,测试的8个小麦育种亲本中TM的抗叶锈性最好,具有很好的抗叶锈病应用潜力,可作为小麦抗叶锈病育种的重要抗源。     

小麦与玉米杂交及单倍体的产生

应用普通小麦不同品种(品系)与苏玉4号杂交,喷洒100ppm的2,4—D一至二次,授粉后子房膨大,其膨大率因品种不同而异。在部分膨大子房中剥取到发育幼胚,经组织培养后,获得单倍体小麦植株,植株未结实。     

黑小麦与普通小麦过氧化物酶和蛋白质的比较研究

以小麦作对照．系统研究了2种黑小麦幼苗生长过程中过氧化物酶(POD)活性的变化．同时利用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对2种黑小麦的幼苗生长不同时期根、芽的过氧化物酶同工酶及其蛋白质进行了分离分析。结果显示：黑小麦POD酶活性高于小麦。黑小麦POD同工酶谱与小麦差异明显．且在幼苗生长不同时期变化显著。幼根与幼芽中可溶性蛋白的合成动态具有明显差异。     

The Production of Haploid Wheat Plants via Wheat X Maize Hybridization

The intergeneric cross between wheat and maize are characterized by a high frequency of formation of hybrid embryos, but maize chromosomes are rapidly eliminated in the first few cell division cycles to produce haploid wheat embryos. If left the embryos on the plants they will soon abort, as a result of the absence or poor development of the endosperm. Embryo rescue techniques should not enable these embryos to grow to plants because of the embryos were extremely young for embryo culture. Viable embryos were obtained at much higher frequenc, if spikes containing cross-pollinated florets were dipped in 100 ppm 2,4-D solution 4 hours after pollination. Of the 382 florets treated, 64(16.8%) embryos were obtained 10 days after treatment, and 47 plants recovered on the culture medium. In control (2,4-D not applied) only 1 (0.96%) embryo and 1 plant was obtained from 104 florets. This simplified technique should enable haploid wheat plants production through wheat - maize to apply to practical breeding.     

云南小麦、西藏半野生小麦和普通小麦叶绿体DNA限制性内切酶图谱的研究

云南小麦(Triticum aestivum ssp.yunnanense King)和西藏半野生小麦(Triticum aestivum ssp.tibetanum Shao) 是我国西部地区特有的两个普通小麦(T.aestivum L.)亚种。我们采用改进的高离子强度法,提取云南小麦、西藏半野生小麦、普通小麦的两个品种(中国春和鄂恩1号)的叶绿体DNA, 并用7种限制性内切酶对它们的叶绿体DNA进行了酶切图谱分析。结果表明:在普通小麦及其两个亚种中没有叶绿体DNA的限制性片段长度差异,反映了叶绿体基因组在进化过程中相对的稳定性。 Abstract:Yunnan wheat(Triticum aestivum ssp. Yunnanense King) and Tibet semiwild wheat (Triticum aestivum ssp. Tibetanum Shao) are two endemic subspecies of common wheat (T. eastivum L.) in the west of China.Improved high ionic strength medium was adopted to extract the cpDNAs of Yunnan wheat,Tibet semiwild wheat and two cultivars of common wheat (Chinese Spring and Een 1).Restriction fragment analysis of cpDNAs was carried out with the use of 7 restriction enzymes.The results showed that there was no diversity of cpDNAs from common wheat and the two subspecies,indicating the conservatism of the chloroplast genome during the process of evolution.     

小麦土传病毒在感病小麦细胞中的分布及小麦梭条斑花叶病毒RNA组分

四川雅安、陕西长安的土传小麦病毒病由小麦梭条斑花叶病毒(WSSMV)引起,而浙江安吉、新昌、江苏宜兴的病害则由WSSMV和土传小麦花叶病毒(SBWMV)所致。WSSMV和SBWMV可以同时复合侵染同一株小麦,但在病细胞中二者彼此独立分布。我国WSSMV RNA有2个基因组,分子量分别为2.6×10~6和1.5×10~6,与日本小麦黄花叶病毒(WYMV)一致。     

西北春麦区小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

为了给品质改良提供基础材料,并了解西北春麦区小麦地方品种的遗传多样性,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法,分析了493份小麦地方品种的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的组成.结果表明:在供试材料中,Glu-1位点共有26个等位基因,其中Glu-A1位点3个,Glu-B1位点9个,Glu-D1位点14个,亚基null、7+8、2+12在各自的位点上出现频率最高,分别达到了94.53%、92.92%、86.24%;亚基组成类型共有30种,主要为null/7+8/2+12,频率达79.76%;同时筛选出一些含有1、2*、13+16、14+15、5+10、1.5+10等优质亚基或亚基对的材料,可作为优质基因源;西北春麦区小麦地方品种间Glu-1位点的遗传多样性,以Glu-D1位点最高,其次是Glu-B1位点,Glu-A1位点最低.     

小麦全蚀病菌致病力测定及品种抗病性研究

近年来,小麦全蚀病在我国黄淮麦区的发生呈上升趋势,为了解该病菌的致病力及目前推广品种的抗病性,本研究比较了全蚀病菌致病力的3种接种测定方法和2种病情分级标准,结果表明以蛭石为培养基质、麦种下2cm接种菌丝块和0～6级的分级标准,可比较有效和准确地测定小麦全蚀病菌的致病力。对2010年分离自黄淮麦区河南、江苏、安徽、山东4省10地的52株小麦全蚀病菌进行了致病力测定,结果表明供试菌株的致病力存在明显差异。选取致病性较强的菌株G1037,对69个常用小麦品种进行了苗期抗全蚀病鉴定,结果表明供试小麦品种对全蚀病的抗性水平普遍较低,没有发现免疫和高抗的品种,泛麦5号和太空6号具有较强的抗(耐)性。     

小麦的遗传转化

概述了小麦遗传转化的发展历史与现状,分析了几种小麦转化技术的优势和不足,并对小麦遗传转化中的有关问题作了展望。