木酮糖激酶基因整合表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

【目的】以载体p406ADH1为构建骨架,构建一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株的整合表达载体。【方法】通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为筛选标记的G418抗性基因KanR,用于基因表达的ADH1终止子片段,酿酒酵母W5自身木酮糖激酶基因,18S rDNA介导的同源整合区,插入到骨架质粒p406ADH1中,得到多拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。将该载体线性转化酿酒酵母后,对转化子中木酮糖激酶酶活进行测定,检测其表达情况。【结果】重组质粒在酿酒酵母体内实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达,其酶活力是初始菌株的2.87倍。【结论】本实验构建了一个酿酒酵母工业菌株整合表达载体,并用此载体过表达了其自身的木酮糖激酶基因。该重组质粒载体的构建可以有效解决酿酒酵母中自身木酮糖激酶酶活较低的情况,这为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建和其它酵母重组质粒载体的构建奠定基础。     

酵母整合型载体的构建及其功能分析

选取酿酒酵母基因组rDNA序列中25S和5S rDNA之间的一段约2.2 kb序列作为整合载体同源重组到酿酒酵母基因组中的靶位点,PCR扩增得到该段序列左右2段大小分别为865 bp和1 350 bp的片段,将其与 URA3、磷酸丙糖异构酶启动子和终止子序列依次克隆入pUC18中,构建成整合型载体pNK.以绿色荧光蛋白基因为报告基因,荧光显微镜下观察到酿酒酵母菌株INVSc1转化子发出较强荧光,Southern 杂交产生目的条带,这些结果表明载体 pNK 具有整合并表达外源基因功能.通过对转化子连续培养证明构建的整合型载体的稳定性较高.     

整合载体与选择载体共转化酵母菌的研究

以酿酒酵母菌株H158为例,研究了带有rDNA的多拷贝整合载体pMIRY2与选择载体pFAKnaMX4的共转化率,得到了共转化过程中两种载体的最佳比率为3-4：1,得到的共转化子在完全培养基中连续传代培养5d即可得到去除G418抗性标记基因的转化子,转化子的稳定性达到90%以上,实验表明该系统适合于外源基因在酵母中的稳定表达。     

产肌醇酿酒酵母基因工程菌的构建

【目的】过表达酿酒酵母肌醇合成关键酶基因INO1,促进肌醇合成,构建能够分泌肌醇的基因工程菌株。【方法】构建r DNA介导的INO1基因多拷贝整合表达载体p URIH,电转化酿酒酵母Y01菌株,构建工程菌株YI2-1和YI2-2,荧光定量PCR方法分析INO1基因表达量。敲除Kan MX抗性基因,HPLC检测重组菌发酵液中肌醇含量。【结果】获得INO1基因过表达菌株YI2-1和YI2-2,YI2-1的INO1基因表达量是出发菌Y01的16.235倍。敲除Kan MX抗性基因的菌株命名为YI2-1△KP,初步检测YI2-1△KP产肌醇量为627 mg/L。【结论】r DNA介导的INO1基因多拷贝整合表达载体p URIH能够有效地过表达目的基因;过表达菌株合成的肌醇不仅能满足自身的需要,而且能够向胞外分泌,具有潜在的工业应用价值。     

糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM的构建

对糖多孢红霉菌染色体上红霉素生物合成基因进行改造 ,已经合成了多种红霉素类似物。在糖多孢红霉菌中对红霉素类似物进行结构修饰 ,以pWOR1 0 9质粒为基础构建糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM。pZM载体带有PermE启动子、fd终止子、多克隆位点、硫链丝菌肽和氨苄青霉素抗性基因、以及在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中复制的ColE1ori和pJV1ori复制子 ,系可在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中扩增的穿梭质粒。在糖多孢红霉菌中 ,pZM可以表达氨普霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因 ,从糖多孢红霉菌中提取的表达质粒酶切图谱与转化前一致 ,表明pZM是糖多孢红霉菌中多拷贝、稳定的表达载体。     

黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工业用酿酒酵母中的共表达

构建了黑曲霉糖化酶、木聚糖酶基因双表达的酵母YIp型载体pNEW4,通过与G418抗性质粒共转化,将糖化酶和木聚糖酶基因表达元件整合到多倍体酒精生产用酵母S. cerevisiae2.346染色体上,获得了整合型分泌表达这两种酶的工业酿酒酵母工程菌株GX11,研究了重组糖化酶和木聚糖酶在酵母工程菌中的表达及性质。     

植酸酶和甘露聚糖酶双功能毕赤酵母工程菌的构建和产酶分析

根据已发表的植酸酶基因和甘露聚糖酶基因序列设计并合成引物,应用PCR技术,分别以土曲霉总DNA和质粒pHBM1201为模板,扩增出均不含假定信号肽序列的植酸酶基因phyA和甘露聚糖酶基因man,将它们各自克隆到毕赤酵母表达载体pHBM907C上,分别得到重组质粒pHBM907C-phyA和pHBM907C-man。将质粒pHBM907C-phyA上由乙醇氧化酶(AOX1)启动子和终止子引导表达、酿酒酵母α信号肽序列引导分泌的phyA表达盒式结构插入到质粒pHBM907C-man中,构成双基因表达分泌质粒pHBM907C-phyA-man。pHBM907C-phyA-man经SalⅠ酶切线性后转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得了同时分泌表达植酸酶和甘露聚糖酶的双功能酵母工程菌。研究了该酵母工程菌所分泌表达的重组植酸酶和甘露聚糖酶的相关酶学性质,并进行了双功能酵母工程菌的稳定性测试。     

农杆菌介导凝乳酶基因转化黑曲霉载体的构建

目的:研究针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因( glaA)位点,构建含有潮霉素抗性的农杆菌介导的牛凝乳酶基因转化黑曲霉基因置换载体,并在潮霉素基因两端设计了正向重复序列,使在后续的研究中消除抗性基因成为可能.方法:将glaA上游( Gla5)和下游(Gla3)片段作为同源臂,通过重叠延伸PCR技术连接在Cym基因两端构成GlaA5-Cym-GlaA3( CYM)片段,并在潮霉素基因下游引入与Cym基因下游方向相同的Gla3,通过中间载体获得GlaA5-Cym-GlaA3-hph-Gla3结构.结果:将上述结构克隆至在T-DNA区内只含有多克隆位点的Ti质粒载体pSZA,经过酶切鉴定,成功获得载体pSZH-CYM.     

油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建

根据已知序列设计引物,通过PCR扩增获得质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因序列。先将该酶4个亚基的基因进行拼接,然后将这4个拼接好的片段,克隆到pMD18-T载体上,得到质粒pH BM714。再以质粒pHBM714 DNA为模板,用分别带有CpoI和Asc I酶切位点的引物进行PCR扩增,PCR产物在dTTP的保护下经T4 DNA聚合酶处理,与将质粒pHBM720DNA纯化后经CpoI和AscI双酶切后得到的大片段连接,连接产物转化大肠杆菌Xl_(10)-gold,得到正确的重组子命名为pHBM726。此质粒pH BM726,即为带有壮观霉素抗性基因(aadA)筛选标记的质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因油菜叶绿体单交换表达载体;在此载体中壮观霉素抗性基因(aadA)、乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因(ACC)和绿色荧光蛋白基因(gfp)共6个基因串联在一起,共用一个启动子序列,一起来进行表达;通过酶切检测、PCR验证和测序验证,均表明该表达载体构建成功。最后此载体在大肠杆菌中表达时,发现重组菌能够在含壮观霉素的培养基上生长,且在可见光下,能看到绿色荧光,表明壮观霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因均在大肠杆菌中成功表达;表达产物通过Western印迹验证表明组成乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因在大肠杆菌中成功表达。以上结果表明,该表达载体中串联排列的这6个基因均在大肠杆菌中成功表达。该研究结果可为质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转叶绿体的研究奠定基础,为油菜油脂代谢研究提供参考。     

稳定遗传的染色体组合整合酿酒酵母重组菌株的构建

染色体整合表达可获得稳定遗传的基因工程菌,是工业酿酒酵母育种的重要手段。pAUR135整合载体是抗生素标记基因可循环使用的载体,添加特定的同源臂后可构建在酵母染色体上稳定遗传的菌株。目前对酵母菌的分子育种常需要对多个基因进行过表达,利用pAUR135载体可将不同基因分别整合在不同染色体或相同染色体的不同位点,这种组合整合表达方法可对不同基因的表达强度比例进行调节,构建表型优化的工业酿酒酵母菌株。本研究以木糖代谢途径基因为例,构建了3个pAUR135整合载体,将3个木糖代谢基因依次整合到工业酿酒酵母染色体的不同位点,获得了染色体组合整合表达的代谢工程菌株。与将这3个基因整合在同一个位点的对照重组菌株相比,染色体组合整合的重组菌株木糖利用率提高了24.4%–35.5%。多基因染色体组合整合方法从新的角度对工业酵母进行代谢工程改造,所获得的工程菌株不带有任何外来基因和选择标记,可以保持性状的稳定,是工业酿酒酵母分子育种的新方法。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

从黑曲霉糖化酶高产株T2l合成的糖化酶cDNA,经5’端和3’端改造后克隆到酵母质粒YFDl8上,转化酿酒酵母。转化子的淀粉培养基平板检测,培养滤液蛋白电泳和糖化酶活力分析都表明,含有糖化酶基因表达质粒的酵母转化子能有效地分泌有功能的糖化酶到细胞外。实验证明酵母a园子启动子和分泌信号序列能促使黑曲霉糖化酶cDNA在酵母中表达和分泌．实验还表明．黑曲霉糖化酶原的翻译后加工序列很可能亦能被酵母识别,加工生成有功能的成熟的糖化酶。以上成功为构建有实用意义的淀粉水解酵母工程菌迈出了重要的一步。     

黑曲霉木聚糖酶在工业酒精酵母中的分泌表达

用重叠延伸PCR方法从黑曲霉 (Aspergillusniger)UV 11的基因组DNA中克隆出木聚糖酶的cDNA基因 ,构建了由酵母乙醇脱氢酶 (ADH1)启动子和终止子引导表达、木聚糖酶自身信号肽引导分泌、rDNA序列介导的酵母整合型分泌表达质粒pAX2。用pAX2与酵母YEp型G4 18抗性质粒共转化野生型工业酒精酵母S .cerevisiae 2 346 ,获得了整合型分泌表达木聚糖酶的酵母重组菌株XY2。发酵分析表明该工程菌能够明显提高酒精生产率     

Genomic integration system based on pBR322 sequences for the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942: transfer of genes encoding plastocyanin and ferredoxin.

Synechococcus sp. PCC7942 recipient strains were constructed for the chromosomal integration of DNA fragments cloned in any pBR322-derived vector, which carries the ampicillin resistance (ApR) marker. The construction was based on the incorporation of specific recombination targets, the so-called 'integration platforms', into the chromosomal metF gene. These platforms consist of an incomplete bla gene (ApS) and the pBR322 ori separated from each other by a gene encoding an antibiotic (streptomycin or kanamycin) resistance (SmR or KmR). Recombination between a pBR322-derived donor plasmid and such a chromosomal platform results with high frequency in restoration of the bla gene and replacement of the chromosomal marker (SmR or KmR) by the insert of the donor plasmid. The integration into the platform depends on recombination between pBR322 ori and bla sequences only and is therefore independent of the DNA insert to be transferred. The desired recombinants are found by selection for a functional bla gene (ApR) and subsequent screening for absence of the chromosomal antibiotic marker. Gene transfer with this integration system was found to occur efficiently and reliably. Furthermore, the presence of the pBR322 ori in the platform allowed for 'plasmid rescue' of integrated sequences. The system was applied successfully for the transfer of the gene encoding plastocyanin (petE1) from Anabaena sp. PCC7937 and for the integration of an extra copy of the gene encoding ferredoxin I (petF1) from Synechococcus sp. PCC7942 itself.     

糖化酶、木聚糖酶融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达

通过RT-PCR方法,以埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)总RNA为模板,克隆出糖化酶(glucoamylase,amyA)基因的成熟肽编码序列(1 857 bp),编码618个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出木聚糖酶(xylanaseA,xynA)基因的成熟肽编码序列(636 bp),编码211个氨基酸.通过重叠延伸PCR( SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌ALX2.在ALX2发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(10.7 U/mL)和木聚糖酶活性( 51.8 U/mL).     

Cloning and amplified expression in Streptomyces lividans of a gene encoding extracellular beta-lactamase from Streptomyces albus G

A 4.9-kb DNA fragment containing the bla gene for the extracellular beta-lactamase (BLA) of Streptomyces albus G was cloned in Streptomyces lividans using the conjugative, low-copy-number plasmid pIJ61 as vector. No expression of bla was observed when this DNA fragment was introduced into Escherichia coli HB101 on a plasmid vector. A 1.5-kb PstI-SstI fragment containing the bla gene was cloned in S. lividans on the nonconjugative, high-copy-number plasmid pIJ702. A tenfold higher yield of BLA was obtained from S. lividans carrying this plasmid than from S. albus G grown under optimal production conditions. The BLA from the clone reacts with beta-iodopenicillanate according to a branched pathway which is characteristic of the original S. albus G BLA enzyme.     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/Hin dⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后加收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3．3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT－1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100％,解离后的质粒稳定性为93％。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酶母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,得到重组质粒pH-BM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达,将重组毕赤酵母KM71（pHBM220）,GS115（pHBM220),GS115(pHBM220),SMD1168（pHBM220）分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃,在其最适反应条件下测得三粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL,重组毕赤酵母KM71（pHBM220）所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三没有太大的差异。