木瓜蛋白酶的研究 Ⅰ.对不同底物水解作用的比较

(一)氢离子浓度对木瓜蛋白酶水解不同合成底物的影响均属于非竞争性类型,即对不同底物的米氏常数皆与pH无关,pH仅影响最大反应速度。因此很可能木瓜蛋白酶的米氏常数即等于其与底物结合的解离常数。(二)甲醇对木瓜蛋白酶水解Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2有抑制作用,但对Cbz-白-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解却有显著的促进作用。(三)甘氨酸乙酯对Bz-精-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解亦有促进作用,但活力提高的程度各不相同。(四)根据以上结果对木瓜蛋白酶的作用机制作了简短的讨论。     

木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶的研究——ⅥⅠ.无花果蛋白酶对不同底物的作用

观察无花果蛋白酶对一些合成底物作用的结果,说明酶的专一性和木瓜蛋白酶相似。它的特点是在pH7.4对白-NH_2的作用速度此对Bz-精-NH_2水解速度还快,并且在一定条件下只有白-NH_2的聚合反应而无供体的水解。酶作用于白-NH_2及Bz-精-NH_2共同存在时的反应速度也和木瓜蛋白酶相似,为在相同条件下分别作用于二者的速度之和。但从对氯汞苯甲酸和溴代乙酸的抑制看来,这两种活力是由同一酶所催化,可能酶对于二种反应的活性中心不完全相同。     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

猪腎脏羧肽酶的提取及其性质的研究

(一)从猪腎脏組織細胞內抽提出一新羧肽酶制剂,能水解牛胰羧肽酶A,B的底物Cbz-甘-苯丙及B-甘-精及其他各种带有Cbz的合成肽。此酶具有較广的专一性,能作用于一般蛋白水解酶和肽酶所不能水解的脯-賴(ε-Tos)或脯-賴间的肽鍵。(二)酶的最适pH在7.5—8.0之間,不被DFP和PCMB所抑制,但能被較高浓度的碘乙酰胺(0.01M)所抑制。对大多数底物酶的反应属于零級反应。(三)酶对10~(-3)MEDTA透析后,活力全部丧失。如加入Co~( ),Mn~( )或Ca~( )等离子能部分或全部恢复酶的活力,但加入Co~( )却能使酶活力提高二倍以上。(四)初步将猪腎脏羧肽酶应用于C端氨基酸組成的測定,并取得較滿意的結果。     

蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ricini,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体.酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸).谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K₁值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L.Γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38%.     

蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ?n,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体。酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸)。谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K_1值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L。γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38％。     

几种蛋白酶对文蛤肉的酶解工艺条件研究

以文蛤为原料,水解度为指标,从胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,胃蛋白酶和风味蛋白酶中选出水解效果较好的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶.并通过实验确定了胰蛋白酶,木瓜蛋白酶单酶水解及两者组合复合酶解文蛤肉的最佳工艺.结果表明:复合水解效果最佳.最佳工艺:先添加胰酶6000 u/g(原料),水解温度50℃,固液比1:3(V/W),pH 8.0,在此条件下水解6 h;然后改变条件,温度55℃,pH 5.5,底物浓度1:3(V/W),添加木瓜蛋白酶2000 u/g(原料),在此条件下水解2 h.通过实验验证,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组合在该条件下对文蛤肉蛋白具有较好的水解效果,其水解度为28.15%.     

用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽

S-苄基-谷胱甘肽是合成谷胱甘肽的一种重要前体化合物。以L-谷氨酰胺为供体,S-苄基-半胱氨酰甘氨酸为受体．用Bacillus subtilis NX-2的γ-谷氨酰转肽酶催化进行转肽反应,合成得到S-苄基-谷胱甘肽。该化合物进行了质谱及核磁共振分析,并得到了初步鉴定。     

海参制备胶原蛋白肽工艺研究

主要研究以海参体壁为原料制备胶原蛋白肽的工艺条件,通过单因素和正交试验对酶解条件进行优化。结果表明,使用木瓜蛋白酶的酶解效果最好,最佳酶解条件为:酶解温度55℃、p H值7.0、加酶量2%、料液比1:30和提取时间3 h,此条件下海参胶原蛋白肽水解度达到14.23%。     

马鹿茸血免疫活性肽的制备及其活性研究

本文以免疫活性和DPPH·的清除能力为指标,研究了用木瓜蛋白酶与中性蛋白酶水解马鹿茸血制备活性肽的条件,并初步探讨了此活性肽的免疫活性与对DPPH·清除能力之间的关系.实验结果表明:当[E/S]为9000 U/g时,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解温度各为50和45 ℃,pH各为7.1和6.8,分别水解2和1.5 h可以获得最佳的酶解效果.在相同蛋白含量的情况下,两酶复合水解物的淋巴细胞增殖率比单酶水解增加了20.8%.免疫活性与DPPH·清除能力之间存在一定的相关性(r=0.957,P<0.01).     

在过量巯基化合物存在时蛋白质中巯基的测定

萘醌与巯基化合物如巯基乙酸、乙硫醇和谷胱甘肽等有当量加成关系。加合物在波长420mμ左右有一吸收峯。虽然改变測定时的溶剂系統或酸碱度会影响此吸收峯位置及高度,但在同一測定条件下光密度增值与巯基浓度的关系符合Beer定律。比較不同巯基化合物(包括巯基乙酸、谷胱甘肽及一些还原型蛋白貭中的巯基)与萘醌反应后光譜性貭的結果,它們的吸收峯位置及消光系数均大致相同。在18N H_2SO_4中每一巯基的毫克分子消光系数皆接近1.9 mM~(-1)巯基。利用巯基乙酸-萘醌加合物可以被乙醚抽提去淨的性貭,可以在过量巯基乙酸存在时测定蛋白貭中的巯基。在过量巯基乙酸存在时测定谷胱甘肽的結果与后者单独测定时完全相同。应用此法测定胰島素被过量20倍巯基乙酸在30℃,pH5,8M脲素水溶液內还原的过程,結果說明,胰島素三个硫硫鍵在6小时內可以定量地轉变为巯基。     

外源DNA导入糯玉米自交系D0代变异植株过氧化物酶同工酶分析

采用改良浸种法分别将甘蔗总DNA与孟加拉超甜玉米自交系总DNA导入糯玉米自交系12-9-10,在D0代分别获得变异植株,采用聚丙烯酰胺垂直电泳法对该植株及供受体进行了过氧化物酶同工酶分析,其结果表明植株D0(糯×甘300)的过氧化物酶同工酶在迁移率Rf5=0.33和Rf6=0.40分别出现一条供体特有而受体没有的酶带,其酶带强弱与供体相同;在迁移率Rf8=0.61出现一条供受体都没有的弱带。植株D0(糯×孟甜300)-2在迁移率Rf6=0.59增加了一条供受体都没有的弱带。说明了外源DNA(或DNA片段)已转移到糯玉米自交系12-9-10中,并得到了表达。     

外源DNA导入糯玉米自交系D_0代变异植株过氧化物酶同工酶分析

采用改良浸种法分别将甘蔗总DNA与孟加拉超甜玉米自交系总DNA导入糯玉米自交系12-9-10,在D0代分别获得变异植株,采用聚丙烯酰胺垂直电泳法对该植株及供受体进行了过氧化物酶同工酶分析,其结果表明植株D0(糯×甘300)的过氧化物酶同工酶在迁移率Rf5=0.33和Rf6=0.40分别出现一条供体特有而受体没有的酶带,其酶带强弱与供体相同;在迁移率Rf8=0.61出现一条供受体都没有的弱带。植株D0(糯×孟甜300)-2在迁移率Rf6=0.59增加了一条供受体都没有的弱带。说明了外源DNA(或DNA片段)已转移到糯玉米自交系12-9-10中,并得到了表达。     

复合酶法水解香菇工艺的研究

【目的】高效提取香菇中的功能性成分,进一步开发利用香菇的食用价值。【方法】以香菇为原料,在单因素试验和正交试验的基础上,研究了复合酶法(纤维素酶、木瓜蛋白酶和5-磷酸二酯酶)水解香菇的工艺条件。【结果】第一步为纤维素酶和木瓜蛋白酶共同水解,加酶量分别为0.2%和0.4%,水解温度55°C,水解时间3 h,初始pH 5.5;第二步为5-磷酸二酯酶水解,加酶量为0.2%,水解温度70°C,水解时间2 h,初始pH 7.0。用此法得到的香菇水解液水解度为39.48%,游离氨基酸得率10.25%,5-核苷酸得率0.768%,多糖得率8.67%。【结论】此香菇水解液富含呈鲜味物质和其它营养物质,可进一步深加工为香菇调味品。     

瓜尔豆种皮酶解提取物抗氧化性研究

以3种蛋白酶对瓜尔豆种皮活性肽进行酶解分离,通过总抗氧化能力测定,筛选出木瓜蛋白酶水解提取物总抗氧化能力最强,分别为碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解提取物的1．95倍和3．34倍。在清除超氧阴离子自由基的测定中,木瓜蛋白酶水解提取物也表现出较强的清除能力,清除率随水解溶液浓度的增加呈正量效关系,当溶液浓度为5．45mg/mL时,清除率达43．37％。通过实验证实瓜尔豆种皮酶解提取物与大豆多肽一样有较强的抗氧化能力。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅳ.活性中心组氨酸残基的羧甲基化

(1)在过量半胱氨酸存在下微量溴代乙酸或碘代乙酸在pH5对木瓜蛋白酶有強烈的抑制作用,当抑制剂与酶的克分子比为0.5时,抑制即达完全。抑制前后木瓜蛋白酶巯基含量不变。溴代乙酸作用后所得到的羧甲基木瓜蛋白酶汞盐結晶,与木瓜蛋白酶汞盐結晶相同。(2)在6M尿素溶液中溴代乙酸与木瓜蛋白酶的作用速度显著降低,底物L-白氨酰胺及抑制剂对氯汞苯甲酸都具有保护作用。这些事实表明溴代乙酸的抑制与木瓜蛋白酶的催化活性有密切关系,其作用点很可能是活性中心所在。(3)以双相电泳层析进行氨基酸組成分析結果指出,溴代乙酸作用点很可能是組氨酸殘基。     

花蚬酶解物清除羟自由基作用研究

探讨了不同蛋白酶酶解花蚬蛋白所得酶解物对Fenton体系产生的羟自由基(.OH)的清除效果,然后进行Sephadex G-25凝胶柱分离酶解产物中的抗氧化活性肽,并测定活性肽相对分子质量分布。结果表明:木瓜蛋白酶在50℃、酶解30 min、pH=7.5、酶质量分数0.15%、m(底物)∶m(水)=1∶2的水解条件下,酶解物对羟自由基的清除效果最佳,清除率为86.9%;胰蛋白酶在温度55℃、酶解时间85 min、pH=8.0、酶质量分数0.30%、m(底物)∶m(水)=1∶2的水解条件下,酶解物对羟自由基清除效果最佳,清除率为89.5%。木瓜蛋白酶酶解物在最大洗脱峰时,清除率为84.73%,在最大峰处酶解物中活性肽的相对分子质量为5.68×103;胰蛋白酶酶解物有两个洗脱峰,在最大洗脱峰处分离组分对羟自由基的清除率很低,在较小洗脱峰处,其清除率为88.49%,该峰处活性肽的相对分子质量为1.165×104。     

微生物酶不对称水解合成S(+)-布洛芬的研究 Ⅱ.反应条件和产物提取

皮状丝孢酵母具有较强不对称水解底物专一性.在试验的五种布洛芬消旋酯中,水解甲酯和异丙酯生成s(+)-布洛芬ee可达97%,乙酯为93%以上;而水解活性以乙酯最强,转化率高于30%.不对称水解最适pH6.5—7.0;温度在28—37℃范围内拆分能力无明显差别.该酵母的水解酶为胞内酶,将酵母细胞制成两酮干粉进行水解可提高立体专一性.产物S(+)-布洛芬可借助于酸碱反应和有机溶剂提取得到,同时回收未水解的酯.     

用聚焦层析法纯化人巯基蛋白酶抑制肽C-hCRI_c

以肾衰病人尿为材料,通过碱变性、酸变性和热变性除去部分杂质和尿蛋白。然后用羧甲基-木瓜蛋白酶-琼脂糖4B亲和层析,最后用多缓冲剂聚焦层析,把人的巯基蛋白酶抑制肽C(human cysteine proteinase inhibitor C,简称 hCPI_C)和其他的hCPI_C分开,制备得高纯度、高活性的hCPI_C。在SDS-PAGE中为均一条带,每mg蛋白可抑制50单位木瓜蛋白酶活性的50-63％。     

酶固定化技术及其在γ-谷氨酰转肽酶中的应用

γ-谷氨酰转肽酶是微生物体内一种结构特殊的异源二聚体酶,该酶能够将γ-谷氨酰基转移到其他氨基酸或肽类物质相关基团,它具有特殊的转肽、自转肽和水解三种催化反应。本研究综述通过吸附法、包埋法、交联法和共价结合法对γ-谷氨酰转肽酶进行固定化。该酶通过定点突变提高活性。它合成γ-谷氨酰基衍生物具有重要工业化应用前景。