碳水化合物的合成研究 Ⅰ.D-果糖-1-磷酸酯及D-果糖的酶促合成

本文报道了用化学与酶促相结合的方法,由二羟基丙酮磷酸酯与D-甘油醛在兔肌醛缩酶的存在下进行酶促不对称合成,一步缩合得到D-果糖-1-磷酸酯,经酸水解后得到结晶D-果糖。用同样的方法,以DL-甘油醛代替D-甘油醛则得到D-果糖-1-磷酸酯和L-山梨糖-1-磷酸酯的混合物。用钙盐结晶的方法分离,得到D-果糖-氯化钙结晶,除去氯化钙后得到单一的结晶D-果糖。母液在Dowex-1 B_4O_7~-型树脂进行梯度淋洗得到L-山梨糖结晶。     

碳水化合物的合成研究——Ⅰ.D-果糖-1-磷酸酯及 D-果糖的酶促合成

本文报道了用化学与酶促相结合的方法,由二羟基丙酮磷酸酯与D-甘油醛在兔肌醛缩酶的存在下进行酶促不对称合成,一步缩合得到D-果糖-1-磷酸酯,经酸水解后得到结晶D-果糖。用同样的方法,以DL-甘油醛代替D-甘油醛则得到D-果糖-1-磷酸酯和L-山梨糖-1-磷酸酯的混合物。用钙盐结晶的方法分离,得到D-果糖-氯化钙结晶,除去氯化钙后得到单一的结晶D-果糖。母液在Dowex-1 B_4O~-_7型树脂进行梯度淋洗得到L-山梨糖结晶。     

U23细菌溶解酶性质的研究

我们对U23细菌溶解酶[1]溶解细菌细胞壁的产物进行了测定和分析,结果证明这是一种属于糖苷酶类型的细菌溶解酶。该酶不溶解几丁质。分子量27,000,等电点pH11.3。酶的结晶具有类似于蛋清溶菌酶结晶的多形性质,因结晶条件不同,获得三种不同形状的酶结晶。     

X射线衍射晶体法解析脱卤酶DehDIV-R结构的研究

R-2-卤代酸脱卤酶能立体选择性水解R-2-卤代酸。解析酶的单晶结构对提高酶的选择性和活性提供了直接的结构指导,是目前酶结构领域研究的前沿。以实验室前期得到的来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶(Deh DIV-R)为研究对象,采用X射线衍射晶体法进行结构解析。采用pp SUMO载体融合表达Deh DIV-R蛋白,依次通过Ni-NTA亲和层析、透析酶切、二次NiNTA亲和层析以及凝胶过滤层析纯化得到单一条带,且均一性好的蛋白。接着对结晶条件进行初筛与优化,得到的最佳结晶条件为0.1mol/L HEPES p H 7,12%PEG 6 000,0.2mol/L Mg Cl2,8mmol/L CHAPS。晶体在上海同步辐射光源BL18U1线站上收集衍射数据,采用分子置换法成功解析获得了分辨率为2.35的Deh DIV-R的晶体结构。Ramachandran图表明98.02%的氨基酸位于最适区,证明了该结构的合理性。Deh DIV-R的纯化、结晶以及结构解析为进一步深入了解其结构和功能奠定了基础。     

康氏木霉β-葡萄糖苷酶的结晶与电镜观察

将已分离提纯的康氏木霉β-葡萄糖苷酶用逐步降低浓度的硫酸铵溶液在一2℃抽提,然后在4—7℃放置11天后在饱和度为50％、45％和40％的抽出液中均出现结晶。利用戊二醛固定和草酸双氧铀负染技术在电子显微镜下观察了β-葡萄糖苷酶结晶,在放大11万倍左右时可看到晶体内酶分子的有序排列。对一葡萄糖苷酶结晶进行选区电子衍射,出现六角形的点阵图。点阵图的排列位置与结晶酶的电子显微镜照片一致。说明该酶的确形成结晶。平面晶格大小为56x 96五o     

大肠杆菌AE109青霉素G酰化酶的分离纯化及性质研究

 由发酵培养液所得大肠杆菌AE109菌体,先经高渗休克处理,继经D-苯甘氨酸-Sepharose 4B和DEAE-纤维素柱层析分离纯化得到青霉素G酰化酶,酶制品在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带,而且可以结晶。在SDS变性条件下解离为α和β两个亚基。 酶性质的研究结果表明,由大肠杆菌工程菌AE109菌株所得青霉素G酰化酶与其亲本大肠杆菌AS1.76菌株所得青霉素G酰化酶性质相同。     

牛脑神经特异性烯醇化酶的大规模制备和结晶

本文建立了一种包括硫酸铵分级,二次DEAE-Sephadex A-50柱,Ultrogel柱和DEAE-Sephacel柱层析的方法,从牛脑中大规模制备神经特异性烯醇化酶,每千克牛脑可得50mg纯酶。该酶是富含Glu,Asp,等电点是4.7的酸性蛋白,分子量50 kD左右。在含硫酸铵的0.05 mol/L咪唑-盐酸缓冲液(pH 7.8)中得到针状结晶。     

Rhodococcus ruber CGMCC3090腈水合酶纯化、酶学性质及结晶研究

Rhodococcus ruber CGMCC309菌株为酰胺酶及腈水解酶双重缺陷菌株,研究表明该菌能产宽泛底物特异性的腈水合酶。对该菌株产生的新型腈水合酶(NHase-3090)进行纯化和结晶,并研究了其酶学性质。采用疏水、离子交换及凝胶过滤3种层析方法,使该酶纯化倍数达到17.14,得率高达26.2%。电泳分析表明,全酶分子量为105 kDa,由α(24.3 k Da)和β(28.0k Da)2个亚基组成,并构成α2β2四聚体。酶的最适p H和温度分别为7.5和30℃。该酶明显受不同金属离子影响。动力学研究表明,Km为178.8 m M;Vmax为209.1μmol/L·min·mg。研究发现3种金属离子Zn~(2+),CO~(2+)和Cd~(2+)有利于酶蛋白结晶。结晶最佳条件是:采用112-34#试剂(0.05mol/L水合硫酸镉、0.1mol/L HEPS和1.0mol/L三水醋酸钠),蛋白质浓度为15 mg/ml,结晶温度为16℃,p H为7.5,结晶时间为30 d。腈水合酶蛋白单晶经X射线衍射,分辨率达到了3.7。该腈水合酶的纯化和结晶为进一步深入研究其结构和功能奠定了基础。     

DL-苯丙氨酸酶法拆分

ＤＬ－苯丙氨酸的拆分是以Ｎ－乙酰－ＤＬ－苯丙氨酸铵为起始原料,经猪肾酰化酶不对称水解作用,再经离子交换色谱分离,减压浓缩得到Ｌ－苯丙氨酸和Ｎ－乙酰－Ｄ－苯丙氨酸结晶。     

超声波对木质纤维素糖化过程影响的研究

将超声波应用在木质纤维素预处理及其酶解糖化过程中,通过SEM、FTIR研究了处理前后纤维素的形态结构和结晶性能,并考察了不同预处理方式对原料 成分的影响和超声波对酶解糖化率的影响。结果表明,超声波作用能有效的破坏纤维素分子中的氢键,降低其结晶程度,而且能有效地提高木质素的脱除率和酶解糖化率。对超声波作用于酶解过程中的机理进行了初步探讨     

融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析

BM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达.研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素(avicel)以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用.     

产外切葡聚糖酶真菌的筛选鉴定及毕赤酵母中的表达

【目的】外切葡聚糖酶是纤维素酶组分中一类对结晶纤维素有降解作用的酶类,如何提高外切葡聚糖酶活力是研究的关键问题。【方法】从筛选鉴定得到的一株产外切葡聚糖酶酶活较高的黑曲霉Asp-524菌株出发,通过PCR技术克隆得到外切葡聚糖酶基因序列,生物学信息分析后,构建了毕赤酵母诱导型表达载体,实现了该基因在毕赤酵母中的成功表达。【结果】抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导5 d后,酶活达到4.74 U/mL。酶学性质分析显示重组外切葡聚糖酶最适pH为5.0,pH稳定性分析显示在pH为4.0-6.0范围内相对稳定,酶活能保持在最高酶活力的80%以上,最适反应温度为50°C,经60°C保温1 h后,酶活仍能保持80%以上。【结论】结果说明该外切葡聚糖酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,这一研究为纤维素酶的实际应用奠定了一定基础。     

假菠萝麻蛋白酶分离纯化及特性研究

从假菠萝麻叶汁中用乙醇分部沉淀法得到一种蛋白酶,对酪蛋白有强烈的水解活性,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００柱层析和ＳＰ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－５０离子交换柱层析等步骤纯化,可得到六角形结晶。结晶酶液经ＰＡＧＥ圆盘电泳,每条胶柱上只显示一条蛋白带,其活性在ｐＨ４。５－１０、５５℃范围内较稳定,最适ｐＨ８．５最适温度５０℃,Ｋｍ（酪蛋白）值为０．１８５％（Ｗ／Ｖ）。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ     

胰脏核糖核酸酶的生理功能和分子结构与进化

各种生物中广泛存在核糖核酸酶(RNase).自1939年Kunitz.首次得到结晶的牛胰脏RNase以来,生物化学家开始对动物胰脏RNase进行多方面的研究.首先是因为胰脏RNase是研究RNA结构的一种重要工具酶.其次,比较胰脏RNase分子中氨基酸的异同和性质,也是深入了解蛋白质结构与功能关系的重要手段,另外,研究进化地位不同的动物     

细菌脱色酶TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究

从嗜水气单胞菌DN322中分离纯化出能够对三苯基甲烷类染料结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿进行有效脱色的脱色酶,命名为TpmD。该酶的亚基分子量为29.4kDa,等电点为5.6。该酶催化上述4种三苯基甲烷类染料脱色反应的适合温度为40~60℃,适合pH范围为5.5~9.0。动力学参数测定结果显示TpmD对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿的Km值分别为24.3、40.65、4.2、68.5μmol-1.L-1,Vmax值分别为19.6、74.1、82.8、115.6μmol.L-1.s-1。结晶紫为该酶的最适反应底物。TpmD催化的脱色反应依懒于NADH/NADPH及分子氧的存在,显示该酶属于NADH/NADPH依赖型的氧化酶类。这是国内外首次关于细菌中三苯基甲烷类染料脱色酶酶学性质的描述。     

琥珀酸脱氢酶的研究 Ⅱ.酶与辅基性质的进一步观察

(一)用结晶胰蛋白酶及结晶胰凝乳蛋白酶处理净化的水溶性琥珀酸脱氢酶,经过对甲酚抽提,硫酸汞沉淀,硫化氢分解及纸电泳纸层析等方法净化得到四种带有不同肽链的腺嘌呤异咯嗪核苷酸。从它们的组成成份的分析以及它们的性质的观察,我们认为它们与已知的腺嘌呤异咯嗪二核苷酸略有不同。肽链是连接在异咯嗪上,其连接方式异于一般异咯嗪蛋白。肽链部份的氨基酸组成的分析结果,证明它们都含有半胱氨酸。(二)琥珀酸脱氢酶中的铁处于还原状态。铁与酶朊紧密结合,它与酶活力有密切关系。(三)无机磷可增加琥珀酸脱氢酶的活力,但琥珀酸脱氰酶的活力并不是必需依靠无机磷的存在,乙二胺四乙酸与丙氨酸也有类似无机磷的作用。     

纤维素酶解速度的可视化表征与限制因素分析

纤维素酶解效率是木质纤维素高效生物转化的限制瓶颈,利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)可以在水相中原位可视化表征纤维素酶分子运动行为,分析单个酶分子的运动速度及其影响因素.研究发现,高效降解结晶纤维素酶分子仅结合于特定结晶表面上的特定位点上,通过单方向运动完成逐层降解,过量酶分子结合于特定表面上会导致持续性运动"塞车"现象.结晶微纤丝的降解不仅取决于酶分子运动速度及其糖苷键断裂效率,更取决于酶分子可及底物的晶面大小及其晶面氢键解聚程度.以新结合模式、新运动模式或新组织模式的纤维素酶系或复合体应是纤维素酶研究的重点方向.     

大肠杆菌乙酰羟基酸合酶I调控亚基IlvN的结晶及其与配体缬氨酸的共结晶

乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是生物体内支链氨基酸合成通路中的第一个通用酶,它是目前市售多种除草剂的靶标．AHAS通常由分子质量较大的催化亚基和分子质量较小的调控亚基组成．催化亚基结合催化必需的辅基(FAD、ThDP和Mg2+);调控亚基可以结合终产物(缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)作为负反馈信号调节全酶的活性．大肠杆菌中AHAS有3个同工酶,每种同工酶都由催化亚基和调控亚基组成．大肠杆菌ilvN基因编码了AHAS同工酶Ⅰ的调控亚基．ilvN基因克隆到pET28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到可溶性的大量表达．表达的蛋白质通过镍离子亲和层析和分子筛层析得到纯化．为了对调控亚基的调节机理有深入了解,对IlvN蛋白进行结晶并对蛋白质与其配体缬氨酸进行共结晶．IlvN蛋白晶体衍射能力为2.6 Å,IlvN与缬氨酸共结晶的晶体衍射能力为3.0 Å.     

遗传信息传递的晶体学解密

生物大分子(如蛋白质等)在生物体内行使功能必须要保证其立体结构的正确性。作为研究大分子高级结构的主要手段,结晶技术结合X-射线衍射技术、核磁共振技术以及电镜技术被普遍应用于高级结构的数据分析。随着这些技术的进一步完善,目前已经能完成蛋白质与配体的共结晶。遗传信息从最原始的DNA或RNA传递到以蛋白质的形式呈现功能的过程是由众多酶或蛋白质复合体催化的多步骤进程,解析其中重要元件的空间结构推动了对这些酶反应机理的深入研究。主要阐述结晶技术在遗传信息传递过程中关键酶或蛋白质复合体的研究中的应用。     

海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B与木聚糖酶XynA CBD结构域融合基因的构建、表达及融合酶性质分析

海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B是极耐热胞外酶,氨基酸序列分析表明不含有纤维素结合结构域(CBD),对结晶纤维素无活性,但同样菌种来源的木聚糖酶XynA有催化结构域和纤维素结合结构城。用同样极耐热酶CBD区域和Cel12B融合构建重组质粒pET-20b-Cel12B-CBD,经诱导表达后,对结晶纤维素有活性,酶学特性研究表明:最适反应温度为100℃、最适pH为5.8、在pH4.5~7.0时酶活力稳定,90℃保温2h仍有87%的酶活。