GnRH-PEⅡ-luffinS重组嵌合毒素的制备与细胞毒性检测

目的：制备以Ⅰ型促性腺激素释放激素（GnRH Ⅰ）为导向部分,以绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ（PEⅡ）为转膜区,以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS,体外实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：重叠PCR法扩增GnRH-PEⅡ-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶（rEK）切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa、A549、HepG-2、SP2/0和鸡胚成纤维细胞（CEF）的体外细胞毒作用。结果：成功构建了GnRH-PEⅡ-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为94％。GnRH-PEⅡ-luffinS对HeLa、A549、HepG-2和SP2/0的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,而对CEF无作用。结论：重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。     

绿脓直菌外毒素A—嵌合毒素的研究进展

用细菌毒素和植物毒素制备嵌合毒素研制生物导弹的研究越来越引起人们的重视。目前最多用的毒性部分为绿脓杆菌外毒素,本文以ＰＥＡ作为嵌合毒素毒性部分的结构与功能关系、ＰＥＡ嵌合形式及其在临床应用研究中的作用与前景作了简单综述。     

基因工程重组嵌合抗原作为丙型肝炎诊断试剂的应用

利用基因工程重组技术获得了三种嵌合抗原,两种为丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区核壳蛋白Ｃ２２和ＮＳ３非结构区Ｃ３３ｃ双表位的嵌合抗原Ｂ１和Ｂ２,另一种是既具有上述两段优势抗原,还包括ＮＳ４非结构区Ｃ１００多表位的嵌合抗原Ｃ２５。在大肠杆菌水解酶阴性Ｂ株菌中表达的产物,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,Ｂ１,Ｂ２和Ｃ２５嵌合抗原分子量分别为４３,５３和７０ｋＤ,抗原蛋白表达量分别各占电泳蛋白条带的４０％,１０％和     

白喉毒素-白细胞介素2重组嵌合毒素的克隆表达及特异性细胞毒作用的研究

应用PCR技术分别扩增出编码白喉毒素氨基端 389个氨基酸 (DT3 89)的基因片段及人IL 2全基因 ,将两基因串连插入 pET3a载体 ,构建成含有DT3 89 IL 2融合基因的表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1,经表达、纯化后 ,用3 H Leucine掺入法测定其对HUT 10 2细胞的蛋白合成抑制作用。SDS PAGE电泳分析表明 ,表达产物分子质量 (Mr)约为 5 8kD ;重组嵌合毒素能够特异性地抑制高表达IL 2受体的HUT 10 2细胞的蛋白生物合成 ,且有一定的剂量反应关系 ,其细胞半数抑制浓度 (IC50 )约为 3 3× 10 -11mol/L。为进一步研制特异性的抗IL 2受体高表达肿瘤和相关疾病的药物打下了基础。     

重组抗A型肉毒毒素人鼠嵌合单克隆抗体的瞬时表达及中和活性研究

为了制备重组抗A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin A,BoNT/A)人鼠嵌合单克隆抗体并分析中和活性,以BoNT/A作为抗原筛选鼠源抗BoNT/A噬菌体单链抗体库,将筛选得到的鼠源抗BoNT/A特异性单链抗体的重链和轻链可变区分别克隆到pGP5KCγ和pGP5KCκ载体构建表达质粒。表达质粒共转染HEK-293EBNA1细胞,瞬时表达抗BoNT/A人鼠嵌合单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。蛋白A亲和纯化mAb,分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)分析mAb纯度,小鼠中和试验评价mAb中和活性。结果显示,经过筛选得到4个序列正确且各不相同的抗BoNT/A单链抗体。4个抗BoNT/A人鼠嵌合mAb表达质粒均构建成功并转染HEK-293EBNA1细胞,根据转染效率指示绿色荧光蛋白的表达推测,50%～62. 5%的细胞表达抗BoNT/A抗体。表达上清经过蛋白A亲和纯化,浓度均200μg/mL,单体纯度均90%。小鼠中和试验显示mA1、mA2、mA3和mA4单株抗体均不能完全中和4 LD_(50)的A型肉毒毒素,但从延迟小鼠生存时间可以得出4个抗体的中和活性为mA3mA2mA1mA4。mA1、mA2、mA4中任何一个抗体与mA3连用中和活性为80 LD_(50)/mg。本研究制备了4个具有不同程度中和活性的抗BoNT/A人鼠嵌合mAb,为A型肉毒神经毒素鸡尾酒疗法奠定了基础。     

重组毒素及其衍生物的研究进展

近年来,重组毒素的研究有了很大的进展,一系列重组毒素的衍生物构建成功,突破了原有重组毒素的经典结构框架,在实验动物研究中有很明显的细胞毒和抗肿瘤治疗效应,在临床上也得到初步应用,使用范围也在推广,对它的研究正在不断的深入。     

破伤风毒素C片段基因克隆、重组表达及免疫原性研究

应用PCR技术从破伤风梭状芽孢杆菌DNA中扩增出1．4kbDNA基因,将其克隆到pUC18质粒中,经测序证明该DNA片段为破伤风片段C的基因,并将此基因片段亚克隆到pGEX-4T-2,构建成表达质粒pGEX－TC在E．coli中进行表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹鉴定,表达产物为76KD的特异性重组蛋白。动物实验显示：1μg重组蛋白免疫动物,可使动物产生1IU／ml的破伤风抗毒素单位,动物血清的抗体滴度可达1：800。     

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体,但成本高,来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品,在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究,证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同,纯度达９９％;在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致,纯度达１００％;在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同,等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ,与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中,ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合;在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧;二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致,可代替ＢＳ用于     

绿脓杆菌外毒素A的结构、功能及其重组毒素

绿脓杆菌外毒素A有三个结构功能区.氨基端区(Ⅰ)通过关键位点Lys57结合靶细胞表面受体.中心区(Ⅱ)负责该毒素的跨膜转位功能,Arg276和Arg279是关键位点.在胞吞泡内此毒素于Arg279与Gly280间酶解成28 000和37 000两片段.羧基端区(Ⅲ)所在的37 000片段由其末端氨基酸序列REDLK介导到内质网再转位入胞浆通过Glu553位点结合NAD⁺使延伸因子-2受ADP-核糖基化而抑制细胞蛋白质合成导致细胞死亡.改造的毒素基因同识别蛋白基因融合成的重组毒素有应用前景.     

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。     

重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达

为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp),根据 其基因序列,设计引物从pPIC9K2rHCMVp 上扩增得到目的基因片段,并导入毕赤酵母诱导型表达 载体pPICZαA 中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33 细胞中,筛选获得表达量 较高的重组菌株,研究了该菌株生长的培养条件,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH 值对人巨细 胞病毒嵌合肽表达的影响。2L 发酵罐进行了高密度发酵,经1 %的甲醇、pH610 的条件下诱导 48h,最终菌体密度OD600达到180,每升发酵液中含目的蛋白7817mg,产量比摇瓶提高了418 倍。 rHCMVp 可通过高密度发酵大量获得。     

人I型免疫缺陷病毒gag—env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Ｇａｇ和Ｅｎｖ蛋白是人Ｉ型免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １,ＨＩＶ－１）的结构蛋白,是ＨＩＶ－１诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多交亚克隆,将ｅｎｖ基因以正确的三联密码读框插入ｇａｇ基因的下游制备了ＨＩＶ－１ ｇａｇ－ｅｎｖ嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒ｐ７．５启动子和牛痘病毒Ａ型包涵体（ＡＴＩ）启动子的下游,经过同源     

Neurturin嵌合神经营养因子重组腺病毒的构建及体外活性测定

Neurturin是神经营养因子家族成员,研究发现体外表达的重组Neurturin能够促进多巴胺能神经元的存活,对帕金森氏病的基因治疗有重要意义。但有研究指出野生型Neurturin在细胞中不能完成加工进而不能被分泌到胞外。因此实验对野生型Neurturin进行改造,将NGF的信号肽与Neurturin的成熟肽进行拼接,形成一种嵌合的NGF/NTN基因,并将该基因插入重组腺病毒基因组中,在AD-293细胞中包装获得重组腺病毒。通过免疫荧光和Western blotting证实Neurturin能够在胞内表达,并且能够对其进行加工最后分泌至胞外。最后通过鸡胚背根神经节培养实验证明该嵌合基因能够表达具有明显活性的Neurturin。     

IEF纯化重组A型肉毒毒素保护性抗原

在大肠杆菌中高效表达的重组A型肉毒毒素保护性抗原（rBoNTaH468),是以包涵体形式存在,将表达菌株发酵后,裂解菌体,制备包涵体,溶解后的包涵体溶液经样品处理,通过等地电聚焦制备型电泳纯化,纯化的重组A型肉毒毒素保护性抗原（rBoNTaH468)纯度高于90%,产量及回收率高,纯化的重组表达产物酶联检测具有结合活性,这为下一步A型肉毒毒素抗毒素的研制打下基础。     

重组蓖麻、相思子毒素A链嵌合突变体的制备与分析

目的:构建蓖麻毒素(RIC)、相思子毒素(ABR)A链突变体的嵌合体蛋白,实现嵌合体蛋白的可溶性表达、纯化及抗原性分析。方法:采用柔性linker连接RIC A链突变体(mRICAD75AV76MY80A)和ABR A链突变体(mABRAE164AR167L),构建嵌合体基因mRICA/mABRA,将该嵌合体基因亚克隆至原核载体pQE80L构建表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA,再转化至大肠杆菌M15获得表达工程菌株M15/pQE80L-mRICA/mABRA,工程菌在18℃经0.1 mmol/L的IPTG诱导14 h,表达的嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,通过ELISA和Western印迹检测嵌合体蛋白的抗原性。结果:所获得的mRICA/mABRA嵌合体基因经一致性比对分析,与预计嵌合基因的序列一致性为100%,其开放读框全长1572 bp,编码524个氨基酸残基;重组表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,嵌合体蛋白相对分子质量约为62×103,与预测相符,可溶性的嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,纯度可达99%;间接ELISA和Western印迹结果表明,嵌合体蛋白能同时与抗RIC多克隆抗体和抗ABR多克隆抗体发生特异的抗原抗体反应。结论:得到的mRICA/mABRA嵌合体蛋白具有良好的抗原性,为研制新型RIC和ABR双价疫苗奠定了重要基础。