PI法和Annexin V／PI法检测蓝舌病毒HbC3诱导人肝癌细胞的凋亡

利用流式细胞仪比较PI法和AnnexinV/PI法检测不同时间人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC3的凋亡率分析。结果:PI法在24h、36h、48h的凋亡率分别为10.8±3.05、21.7±6.28、28.3±10.6;AnnexinV/PI法的凋亡率分别为20.42±3.70、49.3±8.11、79.6±11.5。二种方法及不同时间感染病毒细胞的凋亡率之间有显著差异(P<0.01)。证明了AnnexinV/PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞,BTV-HbC3诱导Hep-3B细胞凋亡是致肿瘤细胞病变、死亡的重要表现形式之一。     

自噬抑制肿瘤坏死因子α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞发生凋亡

目的:探讨TNF-α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞(hfPMSCs)发生凋亡和自噬的作用,以及自噬对细胞凋亡的调控作用。方法:利用流式细胞术检测无血清培养hfPMSCs中CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的表达;用终浓度20μg/L的TNF-α处理hfPMSCs 24h,以未处理细胞作为对照组。Annexin V/PI双染色检测TNF-α对hfPMSCs凋亡程度的影响;分别提取各组总蛋白,Western blot检测自噬标志基因LC3Ⅰ/Ⅱ的表达;利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞,观察胞内点状聚集形成的情况;利用Atg5干扰慢病毒(si-Atg5)及阴性对照慢病毒(si-NC)感染hfPMSCs,Annexin V/PI双染色检测TNF-α对慢病毒感染后hfPMSCs凋亡程度的影响。结果:所培养细胞具有典型的MSCs形态,呈CD73~+CD90~+CD105~+/CD14~-CD34~-CD45~-细胞; Annexin V/PI染色结果显示,TNF-α作用24 h后,hfPMSCs凋亡数和凋亡率均高于对照组(P 0. 05);Western blot检测自噬标志蛋白表达结果表明,TNF-α可增加LC3Ⅱ的表达(P 0. 05);荧光共聚焦显微境观察到TNF-α可显著提高细胞中的点状聚集。利用si-Atg5感染细胞,抑制hfPMSCs自噬的发生,与对照慢病毒si-NC感染细胞比较,可显著促进TNF-α诱导hfPMSCs凋亡的发生(P 0. 05)。结论:TNF-α诱导的自噬抑制人胎盘胎儿来源MSCs凋亡的发生,具有一定的保护性作用。     

Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡的影响因素

[目的]探讨消化液、细胞数量及试剂温度对Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡率的影响。[方法]细胞经Accutase或无EDTA胰酶消化后比较检测结果;含有0.5×10^(5)、1×10^(5)、2×10^(5)细胞的样本按照说明书推荐(默认含有1×10^(5)细胞)加入试剂后,比较检测结果;细胞加入室温或4℃试剂后比较检测结果。以上比较均用未处理细胞和秋水仙素处理细胞分别进行。[结果]对于未处理细胞而言,与无EDTA胰酶相比,Accutase能显著减少凋亡率(2.70%vs 18.05%);而经药物处理的细胞,Accutase组凋亡率也有一定程度减少(22.32%vs 26.50%),但差异没有未处理细胞大。未处理细胞随着细胞数量的增加,PI信号并未发生明显改变,Annexin V-FITC信号与细胞数量成反比,统一十字门分析的凋亡率分别是:2.46%、1.85%、1.35%。对于药物处理的细胞差异尤其明显,统一十字门分析的凋亡率分别是:28.83%、21.27%、15.59%,因此不能用统一的十字门分析。加入4℃试剂的未处理细胞的凋亡率明显高于加入室温试剂的细胞的凋亡率(3.77%vs 8.13%),而对于药物处理的细胞,两者基本无差别(22.94%vs 22.18%)。[结论]用Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡率时,使用Accutase消化液;样本严格计数,使细胞数符合说明书要求;使用室温试剂。     

PI3K/AKT途径在大肠埃希菌诱导U937细胞凋亡中的作用

目的探讨PI3K/AKT信号转导通路在大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）诱导的人巨噬细胞系U937细胞凋亡中的作用。方法利用Western blot分析检测E.coli感染不同时间后磷酸化及非磷酸化AKT的表达;预先用不同浓度的LY294002（PI3K途径抑制剂）处理U937细胞60min,观察E.coli感染30min后U937细胞的凋亡情况。结果随着感染时间的延长,磷酸化AKT的表达逐渐下降。加入PI3K的抑制剂LY294002后,U937细胞的凋亡率逐渐升高。结论PI3K/AKT信号转导通路参与了E. coli诱导的U937细胞凋亡过程。LY294002通过特异性地抑制PI3K/AKT活性增加E.coli诱导的U937细胞凋亡率。     

瘦素诱导体外培养大鼠脂肪间充质干细胞凋亡

为观察瘦素诱导体外培养大鼠脂肪间充质干细胞凋亡的作用, 采用胶原酶消化法分离培养大鼠附睾脂肪垫间充质干细胞, 第3代细胞用于实验。细胞免疫荧光化学方法鉴定CD105、Vimentin表达阳性率约80%以上, 10-6 mol/L的瘦素作用细胞48 h、72 h后激光共聚焦显微镜观察分别可见早期及中晚期特征表现; 0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L瘦素分别作用于细胞48 h后, 应用AnnexinⅤ/PI双染色法流式细胞仪检测早期凋亡率分别为2.50%±0.72%、6.78%±1.99%、11.99%±1.58%、17.93%±4.82% (P<0.05); 随着瘦素浓度的增加和作用时间的延长, Caspase-3的活性逐渐增高, 至48 h时达到高峰。说明瘦素可以直接诱导脂肪间充质干细胞凋亡, 从数量上减少脂肪组织的含量。     

miR-21通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控胶质瘤细胞的增殖

探讨miR-21对胶质瘤细胞U87中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PTEN/PI3K/AKT)信号通路相关影响作用研究。脂质体Lipofectamine~(TM)2000将miR-21 inhibitor和miR-21 NC转入U87细胞中,48 h后,RT-PCR检测miR-21表达,MTT法检测细胞活力,Annexin V/PI流式双染检测细胞凋亡情况,Western blotting检测PTEN/PI3K/AKT激活情况及程序性细胞死亡因子4(PDCD4),Bax及Bcl-2的表达。与miR-21 NC组比较,miR-21 inhibitor组miR-21表达量显著降低,U87细胞活力下降,细胞凋亡率提高,PI3K、Bcl-2及p-AKT表达量下调,PTEN、PDCD4及Bax表达量上调,差异均具有统计学意义(p0.01)。miR-21inhibitor能显著的抑制U87细胞的增殖,与PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。     

大肠杆菌感染与人巨噬细胞系U937 细胞凋亡的关系及NF-κB的变化

目的探讨大肠杆菌(E.coli)感染与人巨噬细胞系U937细胞凋亡的关系及核转录因子(nuclear factorkappa B,NF-κB)表达的变化。方法以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测及Hoechst 33258荧光染色观察为指标,研究E.coli感染对人巨噬细胞系U937细胞凋亡的诱导作用;用Western blot方法检测NF-ΚB的表达。结果Ho-echst 33258荧光染色结果表明当细胞与细菌浓度比较低时(1:10)可引起部分细胞凋亡,Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪结果表明,当细胞与细菌浓度比为1:20,1:50及1:100时,细胞凋亡率与对照组相比明显增高,有显著性差异(P<0.001)。NF-κB的表达随着E.coli浓度的增加而逐渐降低。结论E.coli以剂量依赖的方式诱导U937细胞凋亡,在此过程中NF-κB的表达逐渐降低。     

羟基乙酰化姜黄素诱导的声动力治疗对巨噬细胞凋亡与坏死的影响

目的:探讨羟基乙酰化姜黄素(HAC)介导的声动力治疗对人急性单核细胞白血病细胞核(THP-1)源巨噬细胞凋亡的影响。方法:体外诱导THP-1源巨噬细胞,通过单纯药物和单纯超声对细胞存活率的影响优化出声动力治疗的最适条件。将细胞分为4组(1×105cells/ml):对照组、单纯超声组、单纯HAC组和声动力治疗组。应用声动力体外治疗巨噬细胞,药物HAC终浓度为5μg/ml,超声强度为0.5 W/cm2,超声时间为5 min。不同治疗方法后用无血清培养液培养6 h,用CCK-8法测定细胞存活率的变化,用Annexin V/PI法测定细胞凋亡、坏死变化。结果:CCK-8法测得声动力治疗后,细胞存活率明显下降(P0.01),Annexin V/PI法测得声动力治疗后,细胞凋亡率和坏死率均升高,凋亡/坏死比升高(P0.01)。结论:羟基乙酰化姜黄素介导的声动力治疗对THP-1巨噬细胞的凋亡有明显的诱导效应。     

Annexin V-FITC/DAPI细胞凋亡检测法

[目的]建立新的荧光染料DAPI与FITC标记Annexin V联合的细胞凋亡流式细胞术检测方法,以用于具有橙红色荧光的药物处理细胞的流式细胞术凋亡检测。[方法]以倒置荧光显微镜成像和流式细胞仪分别检测不同浓度DAPI对活和死细胞的标记作用。以荧光酶标仪检测不同浓度DAPI处理细胞的荧光信号,并进行相关性分析。以流式细胞术比较Annexin V-FITC/DAPI双染法与Annexin V-FITC/PI双染法对无色和含红/橙色荧光药物导致的细胞凋亡。[结果]DAPI标记可用于区分死细胞和活细胞,DAPI标记死细胞的荧光信号和DAPI的浓度呈线性正相关。Annexin V-FITC/DAPI双染法与Annexin V-FITC/PI双染法相比,二者对不含红橙色荧光药物诱导的多种肿瘤细胞的凋亡检测结果无显著差异。与Annexin V-FITC/PI双染法相比,Annexin V-FITC/DAPI双染法可有效避免药物自身荧光与PI通道重合导致的流式检测干扰。[结论]成功建立了新的Annexin V-FITC/DAPI双染法用于细胞凋亡的流式细胞术检测,该方法能够避免具有红、橙色荧光基团的药物对的干扰检测凋亡。     

多聚ADP-核糖聚合酶抑制剂对高浓度锌损伤 PC12细胞的保护作用

探讨多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对400μmo1/L氯化锌损伤PC12细胞的保护作用及其对锌造成的细胞死亡类型的影响.应用MTT法,免疫细胞化学和Western印迹分别测定PC12细胞的存活率和PARP活性;用Hoechst 33342/PI荧光双染色、膜联蛋白V结合实验及DNA断裂分析等方法检测细胞死亡类型.结果表明在400μmol/L氯化锌的作用下,细胞存活率降至(22.7±4.6)%,PARP活性增强,坏死、凋亡和正常细胞百分比分别为(58.4±6.3)%、(18.0±5.6)%及(23.6±4.2)%;3-AB使细胞存活率提高至(76.9±4.7)%,PARP活性减弱,坏死细胞百分数降至(19.2±5.2)%,而正常和凋亡细胞百分数增加到(43.3±1.9)%和(37.5±6.5)%.实验证明,PARP参与了高浓度锌诱导的PC12细胞损伤,抑制PARP活性可提高细胞的存活率,而这种保护作用在于减少细胞的坏死而非凋亡.     

用YO-PRO-1和PI联合染色定量检测细胞凋亡

经不同浓度staurosporine处理诱导凋亡的G7细胞样品,分别用YO-PRO-1/PI和AV/PI进行荧光染色,借助流式细胞仪检测凋亡情况,将两种检测方法得到的结果进行统计学分析显示,二者有显著的相关性(r=0.9659,P<0.01),且没有显著性差异(P<0.05);另外,上述凋亡细胞样品经YO-PRO-1/PI染色后在荧光显微镜下计数凋亡细胞比例的结果与AV/PI流式细胞仪的检测结果也有显著的相关性(r=0.9903,P<0.01),且没有显著性差异(P<0.05)。以上这些结果表明,用YO-PRO-1/PI对细胞进行染色、借助流式细胞仪和荧光显微镜均能准确地检测细胞凋亡,可替代AV/PI流式细胞仪方法用于细胞凋亡的检测。     

Regulation of PTEN translation by PI3K signaling maintains pathway homeostasis

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药物筛选生物技术与抗细胞凋亡PI3K信号传导路径

细胞信号传导PI3K-Akt路径涉及细胞周期、再生、分化、衰老与凋亡的调控,采用高通量生物技术分析基因表达谱可用于抗肿瘤或抗衰老的基因与药物筛选.化学诱变剂甲磺酸乙酯(ethlmethane sulformate, EMS)处理CHO细胞,筛选到抗10 μM、20 μM浓度lovastatin的E10、E20突变细胞系,将E10细胞再经诱变剂EMS处理,筛选到抗70 μM浓度lovastatin的ZE70细胞系.Igf-2刺激基因突变的肌肉萎缩小鼠肌肉细胞系,Western免疫杂交试验结果显示,PI3K-Akt路径的Akt蛋白质磷酸化功能正常.生长因子Igf-2刺激肌肉细胞系C2C12的cDNA基因芯片实验表明,促细胞再生、分化相关的基因表达上调,细胞凋亡相关的基因表达下调.细胞的基因突变,激素、Igf-2等生长因子刺激,往往是肿瘤发生的病因;但是,Igf-2等可用于抗肌肉萎缩疾病,以及抗细胞凋亡与衰老的药物筛选.     

Characterization of Rab21-positive tubular endosomes induced by PI3K inhibitors

We found that wortmannin, a potent phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibitor, markedly induced the formation of Rab21-positive tubular compartments in A431 cells. By time-lapse fluorescence microscopy of live cells co-expressing fluorescent protein-fused Rab21 and other marker proteins, it was shown that the Rab21-positive tubules in wortmannin-treated cells were derived from Rab5-positive early endosomes, but not from late endosomes, recycling endosomes, lysosomes or the trans-Golgi network. The formation of Rab21-positive tubules was very dynamic and required microtubules. Rab21-positive tubules were also formed by the treatment of cells with 3-methyladenine (3-MA), which inhibits class III PI3K rather than class I PI3K. Furthermore, the loss of PI(3)P correlated with the tubulation of Rab21-positive endosomes in cells co-expressing fluorescent protein-fused Rab21 and a tandem FYVE domain. These results suggest that the lowering of PI(3)P as a result of class III PI3K inhibition may be an important cue for the morphological change of Rab21-positive early endosomes from vesicular to tubular form.     

Structure-based design of thienobenzoxepin inhibitors of PI3-kinase

Starting from thienobenzopyran HTS hit 1, co-crystallization, molecular modeling and metabolic analysis were used to design potent and metabolically stable inhibitors of PI3-kinase. Compound 15 demonstrated PI3K pathway suppression in a mouse MCF7 xenograft model.     

磷酯酰肌醇-4-磷酸与丙肝病毒相互关系的研究进展

丙型肝炎由丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)引起,流行性很强。HCV主要通过毒品注射、输血或器官移植传播;极少数情况下,HCV通过血透析、母婴垂直传染。少部分感染HCV的患者会产生急性丙型肝炎,而大多数人会转变成慢性肝炎,其中1/3的人群病情逐渐恶化,严重时导致肝癌。除了肝脏病变,HCV感染还会引起其他组织和器官的损害。因此,对于HCV感染机制的研究显得尤为重要。近年来,寻找参与HCV复制的关键性宿主因子已成为研究热点,磷酯酰肌醇-4-磷酸(phosphatidylinositol-4-phosphate,PI4P)就是其中之一。该文将着重介绍PI4P及相关蛋白参与HCV生命周期的研究进展,并简要总结相关的鞘脂和胆固醇的生理功能。     

PI3K 抑制剂抗肿瘤临床研究进展

磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K) 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,在介导细胞生长、发育、分裂、分化和凋亡等过程中发挥重要作用,因此 PI3K 抑制剂的开发已成为当前抗癌新药研究的热点之一。目前已有多个 PI3K 抑制剂进入临床研究阶段或已上市,其单用或与其他药物联 用的疗效和安全性有待进一步临床验证。综述 PI3K 抑制剂作为抗肿瘤药物的临床研究进展,为其进一步研究与应用提供参考。     

PI3K和Akt蛋白在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的表达

目的研究异丙肾上腺素(ISO)致大鼠心肌肥厚中PI3K和Akt在心肌组织中的表达,为探讨心肌肥厚的信号转导机制和逆转心肌肥厚提供形态学资料.方法健康成年SD大鼠20只,随机分为实验组、对照组,每组10只.实验组给予异丙肾上腺素处理.1周后处死大鼠,取心肌组织,常规石蜡切片,HE染色,观察心肌组织的病理变化,测量心肌肥厚指标;免疫组织化学染色和免疫荧光染色,检测p-PI3K和p-Akt的表达及分布.结果实验组大鼠心肌肥厚指标与对照组相比均明显升高;免疫组织化学检测显示,实验组心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达面积和平均光密度较对照组高.免疫荧光检测实验组心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达较对照组高.结论小剂量持续给予 ISO 能建立大鼠心肌肥厚模型;p-PI3K和p-Akt蛋白表达均与心肌肥厚的发生和发展过程相关,PI3K/Akt信号通路激活,可能是导致心肌肥厚的机制之一.