表面活性剂对纳豆芽胞杆菌产维生素K2(MK-7)的影响

纳豆芽胞杆菌因具有发酵生产维生素K2的能力而备受关注,但由于维生素K2分子量较大,很难通过自由扩散分泌至胞外。为了促进维生素K2的胞外分泌,进一步提高产量,本研究以前期诱变选育获得的一株纳豆芽胞杆菌ND-1-A27为研究对象,考察不同种类表面活性剂对维生素K2浓度、菌体生长、细胞形态及细胞膜流动性的影响。结果表明：非离子型表面活性剂Triton X-100、聚氧化乙烯(POE)和Tween 40在一定添加用量范围内对菌株ND-1-A27发酵生产维生素K2均具有促进作用,其中添加1 g/L的Triton X-100促进效果最佳。在此条件下,菌株发酵生产MK-7产量提高到37.96 mg/L,比对照提高了143.18%。     

碳、氮源对纳豆芽孢杆菌R127发酵产维生素K2的影响

维生素K2是一类重要的脂溶性凝血维生素,在凝血、抗骨质疏松等方面具有重要作用。以本实验室自主筛选的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)R127发酵生产维生素K2,考察不同含量的碳源、氮源对纳豆芽孢杆菌生长、底物消耗和维生素K2合成能力的影响,并探究了维生素K2的分泌情况。结果表明,50 g/L甘油质量浓度最佳,K2产量达到15.8 mg/L;氮源浓度与生物量成反比,与维生素K2合成量呈正比;此外,在发酵过程中,一部分维生素K2以水溶性的形式分泌到细胞外,分泌率约68.8%。     

响应面法优化维生素K_2(MK-7)发酵条件

对实验室保藏的一株维生素K2(MK-7)高产菌的摇瓶发酵条件进行优化,结果表明菌体在静置培养状态下比在摇瓶培养状态下能够合成更多的维生素K2;同时发现玉米粉经过高温淀粉酶液化之后非常适合作为合成维生素K2的碳源。最后利用响应面法对发酵培养基中主要因素的最适宜水平及其交互作用进行了研究与探讨,优化后维生素K2产量由7.09 mg·L-1提高到了67.22mg·L-1,高于文献报道值。     

纳豆芽孢杆菌产VK2菌株的NTG与N＋注入复合诱变选育

以纳豆芽孢杆菌BN-2-6为出发菌株,利用亚硝基胍（NTG）和N＋注入复合诱变选育产维生素K2的突变株。经过NTG诱变后得到突变株BN-N30—1,其维生素K2的产量提高了53％,继而采用低能N＋注入技术进行处理得到突变株BN-P15—11-1,维生素K2的产量比BN—N30—1提高了96％,比原始菌株提高了166％。结果表明,对纳豆芽孢杆菌BN-2-6进行NTG和低能N＋注入复合诱变的效果明显,突变菌株维生素K2的产量显著提高。     

毕赤酵母Gpn12异戊烯基转移酶NovQ催化合成MK-3

对异戊烯基转移酶NovQ在毕赤酵母Gpn12异源表达过程中诱导剂甲醇添加量进行了探究,并以毕赤酵母Gpn12全细胞为酶源,以甲萘醌、异戊烯醇为前体,催化合成维生素K2(MK-3)。每24 h添加2%甲醇时,NovQ表达量提高约36%。考察摇瓶中初始pH、温度、甲醇添加量、前体(甲萘醌、异戊烯醇)添加量、催化时间、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)添加量等7个因素对Gpn12全细胞催化合成MK-3的影响,发现催化温度、甲萘醌添加量、催化时间影响显著,对3个显著因素进行响应面优化得出催化条件为:催化温度31.56℃,甲萘醌添加量295.54 mg/L,催化时间15.87 h,优化后的摇瓶MK-3产量达到98.47 mg/L,与响应面预测结果一致,较优化前对照组提高了35%。在30 L发酵罐进行生物催化实验,催化时间24 h,细胞催化剂浓度220 g(干重)/L,MK-3产量达到189.67 mg/L。该方法为Gpn12规模化生产MK-3奠定了一定的基础。     

纳豆芽孢杆菌发酵生产维生素K2的生物合成途径及其基因调控

阐述了用经过物理和化学诱变后,筛选得到的纳豆芽孢杆菌发酵生产维生素K2的方法,VK2的生物合成途径以及分子生物学机制,并简要介绍了VK2的临床应用。为进一步研究与开发VK2提供理论依据。     

维生素K2对心血管疾病作用的研究进展

摘要：心血管疾病（CVD）目前是人类面临的重大健康问题之一,也是全球人口死亡的首要原因。近年来,国内外研究发现维生素K2对于防治许多心血管疾病发挥着重要作用。维生素K2主要由人体肠道微生物代谢产生,人类也可以通过细菌发酵类食品如纳豆和奶酪等获得,这反映出细菌与人共生关系的重要性。大量临床试验和基础医学实验表明,维生素K2参与羧化维生素K依赖蛋白（VKDPs）,具有防治骨质疏松症、改善血管钙化、减少炎性因子释放和提高胰岛素敏感性等功能。本综述主要分析维生素K2在心血管疾病的研究进展和前景。     

维生素K_2合成途径中主要酶对MK-7产量的影响

对菌株Y-2维生素K_2合成途径中的6个主要酶基因分别进行克隆和表达,以探索不同酶基因对MK-7产量的影响。参照《分子克隆实验指南》完成对基因重组质粒的构建,并对spizizen转化法进行改进,实现重组质粒对菌株Y-2的转化。结果表明,分别过量表达维生素K_2合成途径中的6个基因均能提高MK-7的产量。需要指出的是,过表达基因hep S对MK-7产量的影响最大,其中在摇瓶培养组的产量提高了38%,静置培养组的产量提高了48%。其余几个基因过表达后对MK-7产量的影响则根据培养方式的不同而各有差异。     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中活性表达的比较研究

实现纳豆激酶基因 (nattokinasegene)在大肠杆菌中高活性表达 ,并说明前肽 ( pro序列 )对纳豆激酶的活性表达必不可少。以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板 ,采用PCR方法分别扩增编码信号肽、前肽及成熟肽的序列 ( pre pro NK)和编码前肽、成熟肽的序列 (pro NK) ,构建了大肠杆菌表达质粒 pTYB1 0 1 ,pTYB1 0 2 ,转化大肠杆菌ER2 5 66。在IPTG诱导下 ,分别在 1 5℃ ( 1 4h) ,3 0℃ ( 3h)和 3 7℃ ( 2h)培养。结果可见 ,pTYB1 0 2能表达有活性的纳豆激酶。SDS PAGE表明 ,1 5℃表达杂蛋白更少。薄层扫描显示表达的纳豆激酶占菌体总蛋白的 3 0 %以上。成功制备了表达纳豆激酶的工程菌。     

纳豆菌液体发酵条件的优化

纳豆是日本传统的大豆发酵食品,用以发酵纳豆的菌株即纳豆菌不仅具有分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质的性能,使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分,而且纳豆具有多种保健功能,如溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌、预防骨质疏松、抗氧化等。纳豆菌还能分泌各种酶和维生素,从而可促进小肠黏膜细胞的增殖,保证肠功能的正常。本研究是纳豆菌微生态制剂的研制的一部分。1　材料与方法　①菌种:纳豆菌(Bacillussub tilisvar.natto)BN .0 30 1 ,本实验室保藏。②生物量测定:发酵完成后取1mL发酵液稀释2 0倍(活…     

产腈水解酶菌株的诱变及培养优化

对实验室保存的1株产腈水解酶的Rhodococcus rhodochrous菌株采用氯化锂进行诱变处理,筛选得到了1株产酶活力较高的菌株tg1-A6。经过优化得到培养基的配方为(g.L-1):葡萄糖10,谷氨酸钠10,酵母膏3,己内酰胺7,MgSO40.5,K2HPO40.75,KH2PO40.75。当培养温度28℃,摇床转速200 r.min-1,初始pH值7.0,通过补加葡萄糖,该菌的腈水解酶酶活可达到26.77 U.mL-1。     

纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法：将纳豆激酶酶原（pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶（natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%,活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍,结论：纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。     

一株产甲萘醌-7(MK-7)菌的分离鉴定及产物合成条件的初步研究

本文从豆豉中分离出了一株高产MK-7的菌株并对其进行了鉴定,同时对该菌合成MK-7的条件进行了初步研究.在参照《伯杰氏细菌鉴定手册》,并根据形态学特征、生理生化特性、并结合16S rDNA序列分析结果,该菌属于解淀粉芽孢杆菌.该菌合成MK-7的最佳条件为:发酵温度37℃、装液量为30 mL/250 mL、接种量为2％和摇瓶培养时间为3h.研究发现,菌株Y-2合成的MK-7主要存在于细胞内.以上结果可为基于菌株Y-2选育高产MK-7菌株和实现MK-7的产业化提供理论依据.     

功能膜微域在七烯甲萘醌合成过程中的作用解析

功能膜微域(functional membrane microdomains, FMMs)是细菌细胞质膜上富含脚手架蛋白和聚异戊二烯类物质的结构域,参与细胞生命活动的多个过程。本研究主要聚焦于揭示FMMs与MK-7之间的相关性,并对MK-7合成进行代谢调控。首先,通过荧光标记初步确定FMMs和MK-7在细胞膜上存在相关性;其次通过分析FMMs破坏前后细胞膜上MK-7含量的变化以及细胞膜有序度的变化情况,明确MK-7是FMMs的聚异戊二烯类关键组分;接下来,采用可视化分析探究MK-7合成过程中部分关键酶的亚细胞定位,并通过FloA将胞内游离的途径酶Fni、IspA、HepT和YuxO定位至FMMs中,进而实现MK-7合成途径的区室化,最终成功获得一株高产MK-7的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BS3AT,摇瓶水平MK-7产量达到300.3 mg/L,3 L发酵罐中MK-7产量为464.2 mg/L。     

代谢工程在维生素生产中的应用及研究进展

维生素是维持人体生命活动必需的一类有机物质,机体本身一般不能合成或合成量不足,因此需经食物或其他强化产品获取。目前,维生素产品已广泛应用于医药、食品添加剂、饲料添加剂、化妆品等领域,而且全球对维生素的需求也是呈逐年增长态势。维生素的生产方法主要包括化学合成法和生物合成法。化学合成法通常安全隐患大、反应条件严苛、废物污染严重,相比之下,代谢工程生产维生素绿色环保安全、能耗低,因此建立微生物细胞工厂具有重大的科学意义和应用需求。文中回顾了近30年来代谢工程在维生素生产领域的研究进展,详细阐述了水溶性维生素(维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12和维生素C的前体)和脂溶性维生素(维生素A、维生素D的前体、维生素E和维生素K)的生物合成研究现状,并对其发酵生产的瓶颈进行了探讨,最后对合成生物技术创建维生素生产菌种进行了展望。     

干旱胁迫下四倍体刺槐幼苗水分利用效率及稳定碳同位素组成的研究

在模拟自然干旱的条件下,测定2个四倍体刺槐品种(K2、K3)和普通二倍体刺槐(K1)一年生组培苗的长期和瞬时水分利用效率(WUE)及其稳定碳同位素组成(δ13C),以探讨四倍体刺槐的抗旱机理.结果表明,K2、K3的长期水分利用效率(WUEL)在不同水分胁迫条件下都显著高于K1,它们在同等供水条件下比K1具有更大的生物量产出;3个材料叶片的瞬时水分利用效率(WUEI)均随干旱胁迫的加剧表现先升后降的趋势,且胁迫处理均高于适宜水分处理.随水分胁迫的加剧,各品种刺槐苗木叶片的δ13C显著升高;K2、K3的δ13C在各水分条件下均高于K1;各材料叶片的δ13C与其WUEL有良好的正相关性,可以作为筛选高WUE刺槐品种的指标.     

晚发性维生素K缺乏症并颅内出血36例误诊分析

晚发性维生素 K缺乏症是指新生儿晚期 (出生 2周后 )到乳儿期因缺乏维生素 K而引起的出血性疾病 ,具有起病急、病情重 ,合并颅内出血时预后不良。但由于早期临床表现各异 ,误诊率较高 ,因延误治疗而导致死亡或留有严重的并发症。我院自 1 986～ 2 0 0 0年共收治本病 96例 ,误诊 3 6例 ,误诊率 3 6 .5 %。现将误诊病例作一临床分析 ,以提高对晚发性维生素 K缺乏症的认识。1　临床资料1 .1　一般资料　 3 6例中 ,男 2 4例 ,女 1 2例 ;产后 2周～ 2个月 2 8例 ,～ 3个月 5例 ,～ 6个月 2例 ,1岁 1例。 98%为单纯母乳喂养 (其中有 2 8例产妇分…     

生孢囊放线菌及其它属菌的甲基萘醌

用高压液相层析对31个属90株生孢囊放线菌及其它属菌的甲基萘醌进行了测定。其结果表明：游动放线菌属．小瓶菌属和小单孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H4)MK-10(H4),无定形孢囊菌属和游动单孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H4),指孢囊菌属的甲基萘醌为MK-9(H8)MK-9(H4),链孢囊菌属的甲基萘醌为MK-9(H4)或MK-9(H6),螺孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H6)MK-9(H4),游动双孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H2)MK-9(H4)。不同放线菌属的甲基萘醌组份是较稳定的,可作为属的分类特征之一。建议用甲基萘醌与形态和细胞壁化学组份相结合区分放线菌中的不同属。     

纳豆中抗氧化肽的分离纯化与活性研究

从发酵的纳豆中提取具有抗氧化活性的多肽,通过分子筛层析和反相高效液相色谱对纳豆上清液进行分离纯化,并采用电喷雾串联质谱进行结构鉴定.结果表明:纳豆发酵后的蛋白(多肽)混合物经Sephadex G-50凝胶色谱进行分离纯化后得到3个组分(F1、F2和F3),其中组分F3的抗氧化活性最强,总还原力达到(8.4±0.6)mm...     

纳豆激酶粗提液的体外溶栓抑菌实验

目的探讨纳豆激酶粗提液的体外溶栓、抑菌作用.方法以大豆为培养基,米曲霉为菌种,发酵制得成熟纳豆,用不同饱和度(NH4)2SO4对粗提液进行盐析,所得沉淀溶于生理盐水中,用纤维蛋白平板法测定其活性,确定提取纳豆激酶的分级沉淀范围.用体外溶栓法测纳豆激酶粗提液的体外溶栓作用.用平板打孔法及纸片扩散法测不同浓度纳豆抑菌物质的体外抑大肠杆菌作用.结果纳豆激酶的(NH4)2SO4分级沉淀范围选择在60%.纳豆激酶粗提液对血块的溶解作用较同样活力大小的尿激酶强.纳豆抑菌物质粗提液对大肠杆菌都具有一定的体外抑制作用,当浓度大于50%,抑菌圈直径随着浓度的增高而增大.结论纳豆激酶粗提液具有较好的体外溶栓作用,并对大肠杆菌具有一定的抑制作用.