ipt与PAPⅡ基因在烟草中共表达减轻PAPⅡ细胞毒性的初步研究

利用农杆菌介导方法,分别将PAPⅡ单基因、PAPⅡ基因和异戊烯基转移酶基因(ipt)共表达的双基因(PAPII-pt)导入烟草品种K326叶细胞中,半定量RT-PCR分析了转基因植株中PAPⅡ、ipt和核糖体蛋白大亚基基因(RPL3A)的表达,并进行了TMV攻毒实验.结果表明:双基因PAPⅡ-ipt对烟草的转化频率高达...     

铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析

为了揭示铁皮石斛(Dendrobium officinale)甾醇C-24甲基转移酶2基因(DoSMT2)在甾醇代谢过程的功能,该研究通过根癌农杆菌介导法将来源于铁皮石斛的DoSMT2基因转化烟草(Nicotiana tabacum),并采用qRT-PCR技术检测DoSMT2基因在转基因烟草叶片中的表达,采用气相色谱质谱法分析菜油甾醇和谷甾醇的含量。结果显示:(1)成功获得DoSMT2基因的开放阅读框(1 119 bp),并成功构建正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2,经农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草并鉴定,获得4株阳性转基因烟草植株。(2)Southern blot结果表明,4株转基因烟草植株都有1条杂交信号带,而非转基因烟草植株没有,说明外源DoSMT2基因都以单拷贝整合到4株转基因烟草基因组中。(3)qRT-PCR检测显示,非转基因烟草未检测到外源DoSMT2基因的表达,4株转基因烟草都能检测到DoSMT2基因的表达,且表达水平差异极显著,各株系表达量高低依次为P3P1P2(P4)。(4)气相色谱质谱分析显示,转DoSMT2基因烟草叶片的菜油甾醇含量均极显著低于非转基因烟草叶片,而谷甾醇含量均极显著高于非转基因烟草叶片。研究表明,DoSMT2具有催化24-亚甲基胆甾烯醇转化形成24-亚乙基胆甾烯醇活性。     

农杆菌介导蜡质基因WIN1转化烟草的初步研究

WIN1与蜡质代谢过程中基因的表达相关,本研究首先从野生型拟南芥花蕾中提取总RNA扩增成SHN1/WIN1,以载体PBI121为基础构建植物表达载体PBI121-SHN1/WIN1,然后利用农杆菌介导法将目的基因WIN1导入烟草k326中,在不同阶段选择四种不同培养基进行培养,其中烟草叶盘共培养培养基T1为：MS+1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA;烟草滤菌培养基T2为：MS+1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA+500 mg·L^-1 Carb;烟草筛选培养基T3为：MS+100 mg·L^-1 Kan;烟草继代培养基T4为：MS+80 mg·L^-1 Kan+300 mg·L^-1 Carb。本实验利用植物基因工程手段将WIN1基因整合入烟草K326中,改变烟草k326总基因序列。通过PCR、RT-PCR检测方法对转基因烟草k326一代进行鉴定得出WIN1基因成功导入烟草K326,最终获得了转基因烟草K326一代品种。本实验研究目标通过转基因技术将WIN1基因插入烟草K326,使其角质膜厚度和成分有所改变,以此来提高烟草K326抗旱、抗寒和抗病等性能,为提高烟草抗逆性特别是抗旱和抗寒性奠定基础。该项初步研究结果不仅对认识和揭示植物角质膜的结构功能具有重要理论意义,而且对应用植物基因工程技术改良和培育抗逆性强的植物优良品种和农业生产都具有重要的应用价值。     

Pttkn1基因异位表达对烟草叶片形态的影响

以红花烟草(Nicotiana tabacum L.)叶片为材料,利用农杆菌介导的叶盘转化法将Pttkn1基因整合到烟草基因组中,获得了转基因植株,研究了该基因对植物形态发生和维管形成的影响,并对其进行了RT-PCR分析。结果表明,转基因烟草植株的叶片形态和叶脉发生了多种变化,包括叶片对称性丧失、出现裂片、皱缩、异位茎、杯状叶片、瘤状结构、叶脉脉序紊乱等。RT-PCR分析表明,该基因仅强烈表达于转基因烟草植株中,而在野生型和组织培养材料中均未检测到该基因的存在。表明Pttkn1基因已经成功转入烟草中,而且在叶片形态发生和维管形成过程中发挥一定的作用。     

应用RNAi技术培育抗TMV病毒转基因烟草

利用烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因构建RNAi干涉载体, 通过叶盘法转化至烟草K326 和龙江911两个栽培品种。对转基因株系的荧光定量PCR分析表明, 不同转基因株系的病毒RNA靶序列都得到一定程度的降解, 抗病性鉴定结果证实, 转基因K326和龙江911两个栽培品种的转基因材料分别有83％和90％转基因株系对TMV呈现免疫级抗性。     

超量表达MrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性

利用农杆菌介导的遗传转化法将含有普通烟草Ubi．U4启动子驱动MrCN基因表达的元件导入TMV敏感烟草品种K326中,对筛选鉴定出的T0代转基因植株接种TMV,测定其接种前后不同时期的理化指标,以接种TMV的野生型植株为对照。结果显示,转基因植株和野生型植株接种TMV前叶绿素（Chl）和MDA含量YLSOD、POD和CAT酶活力均无显著差异,但接种TMV后野生型植株Chl含量逐渐降低,转基因植株Chl含量先增后降,在接种TMV后5d时转基因植株叶片Chl含量显著高于野生型植株。接种前期（0-3d）转基因植株MDA含量略低于野生型植株,但差异不显著;但接种后期（3～5d）前者的MDA含量显著低于后者。接种TMV后转基因植株中SOD、POD及CAT酶活性变化幅度较野生型植株高,以CAT的变幅最为显著。另外,Real-timePCR分析结果表明,接种TMV后3d时转基因植株删蹦、PR-1α及NrCN表达量均显著高于野生型植株。以上结果表明,通过转基因技术提高烟草抗病基NNrCN的表达量,能提高防御酶活性及病程相关基因的表达量,从而延缓植株感染TMV的发病时间,增强敏感植株对TMV的抗性。     

转PvP5CS2基因烟草对干旱胁迫的反应

为了验证普通菜豆脯氨酸合成酶基因PvP5CS2在改善作物抗旱性方面的作用,构建了普通菜豆PvP5CS2基因的烟草表达载体pCAPE2-PvP5CS2,利用农杆菌将PvP5CS2导入烟草,获得15株阳性转PvP5CS2基因植株。干旱胁迫条件下,转基因烟草植株和野生型植株叶片中脯氨酸含量、叶片相对含水量和萎蔫叶片数的差异均达到极显著水平。转基因烟草的脯氨酸含量、叶片相对含水量分别是野生型的2．30倍和1．26倍,而萎蔫叶片数只相当于野生型的90％。表明超表达PvP5CS2基因的烟草植株在干旱胁迫条件下能积累较多的脯氨酸,抗旱性得到初步改善。     

拟南芥AtCIPK23基因对烟草抗旱能力的影响

为了探索拟南芥AtCIPK23基因对烟草耐旱能力的影响,对3个转AtCIPK23基因阳性纯合株系KA13、KA14和KA44与野生型烟草K326（对照）进行了自然干旱处理,测定离体叶片的失水速率、叶绿素含量、相对电导率、脯氨酸和可溶性糖含量,并分析了转基因及野生型材料对活性氧的清除能力,对活性氧清除基因NtSOD、NtCAT和NtAPX及干旱胁迫相关基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2的表达量进行检测。结果表明：（1）转基因烟草离体叶片的失水速率明显低于K326;自然干旱7 d后,野生型K326出现了明显的干旱胁迫症状;干旱7 d进行复水后,转基因株系的复水存活率明显高于K326。（2）转基因株系中的叶绿素、脯氨酸及可溶性糖含量比K326显著提高,电导率则明显降低。（3）野生型烟草K326中H₂O₂的积累量明显高于3个转基因株系,转基因株系中ROS清除机制的3个关键基因NtSOD、NtCAT和NtAPX被诱导上调表达。（4）抗旱相关基因NtDREB、NtLEA5和NtCDPK2仅在转基因烟草中受干旱诱导。研究认为,AtCIPK23基因可能具有提高植物抗旱能力的功能。     

转OsMAPK4基因烟草的抗旱性研究与遗传分析

以低温处理的水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板, 用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出OsMAPK4基因, 构建了由E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12。通过农杆菌介导法将OsMAPK4基因导入烟草, 筛选获得25株转基因植株。抗旱性研究结果表明, OsMAPK4基因的超量表达提高了T1代转基因植株的抗旱性。卡那霉素抗性在T1代转基因植株中的分离情况表明, 大多数转基因株系符合单基因遗传规律。     

超量表达NrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性

利用农杆菌介导的遗传转化法将含有普通烟草Ubi.U₄启动子驱动NrCN基因表达的元件导入TMV敏感烟草品种K326中,对筛选鉴定出的T₀代转基因植株接种TMV,测定其接种前后不同时期的理化指标,以接种TMV的野生型植株为对照。结果显示,转基因植株和野生型植株接种TMV前叶绿素（Chl）和MDA含量及SOD、POD和CAT酶活力均无显著差异,但接种TMV后野生型植株Chl含量逐渐降低,转基因植株Chl含量先增后降,在接种TMV后5 d时转基因植株叶片Chl含量显著高于野生型植株。接种前期（0³ d）转基因植株MDA含量略低于野生型植株,但差异不显著;但接种后期（3⁵ d）前者的MDA含量显著低于后者。接种TMV后转基因植株中SOD、POD及CAT酶活性变化幅度较野生型植株高,以CAT的变幅最为显著。另外,Real-time PCR分析结果表明,接种TMV后3 d时转基因植株MAPK、PR-1a及NrCN表达量均显著高于野生型植株。以上结果表明,通过转基因技术提高烟草抗病基因NrCN的表达量,能提高防御酶活性及病程相关基因的表达量,从而延缓植株感染TMV的发病时间,增强敏感植株对TMV的抗性。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的cDNA序列,设计合成了Ap5和Ap3两个引物,应用RT－PCR技术扩增了拟南芥的ABP基因。将该基因克隆在植物表达载体p35SSIN的35S启动子和Nos3’端之间,得到植物表达载体p35SE。通过农杆菌个导的方法对烟草SR1进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗干旱生理效果研究

以冬小麦品种8901、5-98、99-92和104等品种的幼穗和幼胚为材料,用基因枪转化含逆境诱导转录因子DREB和bar基因的质粒pBAC128F（7024bp）。经筛选与植株再生,共获得70多个转基因小麦植株及其后代株系。转基因株系经PCR分析和RNA点杂交检测,结果表明外源转录因子DREB基因已稳定整合到转基因植株及其后代株系中,并且在部分后代株系中获得了表达。叶片脯氨酸含量测定表明,有16个转基因株系的脯氨酸含量与非转基因对照相比,增加相当显著,其中10个株系的脯氨酸含量在1100μg/g以上,比对照提高了2倍多。室内抗旱模拟实验表明,转基因株系停止浇水15d后,叶片仍然表现绿色,而对照叶片则失绿、枯干;复水10d后,转基因株系恢复活力,对照则死亡。研究表明,利用逆境诱导型启动子（rd29B）来增强外源DREB基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在黄瓜中的表达

利用RT_PCR方法从拟南芥 (Arabidopsisthaliana (L .)Heynh .)中克隆了生长素结合蛋白 (auxinbindingprotein 1 )cDNA ,进行了全序列测定。将该基因克隆在pBI1 2 1的 35S启动子和Nos终止子之间 ,得到植物表达载体p35EZ。通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)介导的方法转化黄瓜 (CucumissativusL .)。对转基因植株进行了PCR和Southern检测。所得到的转基因黄瓜植株单性结实能力增强。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在黄瓜中的表达

利用RT_PCR方法从拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.）中克隆了生长素结合蛋白（auxin binding protein 1）cDNA,进行了全序列测定。将该基因克隆在pBI121的35 S启动子和Nos终止子之间,得到植物表达载体p35EZ。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend) Conn）介导的方法转化黄瓜(Cucumis sativus L.)。对转基因植株进行了PCR和Southern检测。所得到的转基因黄瓜植株单性结实能力增强。     

表达尾穗苋凝集素基因的转基因烟草对桃蚜(Myzus persicae)繁殖的影响

为研究尾穗苋凝集素(ACA)在植物中可能的抗虫作用,通过RH-PCR克隆了ACA cDNA并通过RACE分析证实了cDNA序列的正确性.构建了ACA基因的韧皮部特异表达载体pBCACAc并通过根癌杜菌介导转化了烟草(Nicotiana tabacum L.).PCR和Southern blot分析结果证明,ACA基因已经整合到转化再生植物的基因组中,其插入插贝数1~4个不等.对转基因烟草叶片蛋白时行行免疫反应的结果表明,ACA基因已被转录和翻译.用桃蚜(Myzuspersicae Sulzer)对转基因烟草离体叶片进行了的接虫试验结果表明,测试过的78%的烟草对桃蚜口密度增长的平均抑制率在75%以上,在抗性植株上观察到有桃蚜若虫死亡的现象.以上结果表明,ACA基因是一个有效的抗蚜基因,在作物抗蚜分子育种具有应具应用价值.     

表达尾穗苋凝集素基因的转基因烟草对桃蚜(Myzus persicae)繁殖的影响(英文)

To investigate the possible function of the agglutinin from Amaranthus caudatus L. (ACA) in plant defending against insect pests, ACA cDNA was cloned by RT-PCR and the 5‘ and 3‘ sequences were confirmed by rapid amplification of cDNA ends (RACE). The phloem-specific expression vector of ACA gene, pBCACAc, was constructed based on the plant binary vector pBC438 and transfered into tobacco plants via Agrobacterium-mediated transformation method. Results from PCR and Southern blotting analysis showed that AOA gene was integrated into the genomes of transformed plants and the transgene integration varied from one to four estimated copies per genome. Western blotting analysis indicated that ACA gene was transcribed and translated in the transgenic plants. The bioassay of Myzus persicae Sulzer on detached leaves demonstrated that the 78% transgenic tobacco plants displayed an average aphid-resistant rate of more than 75%. Some apterous progeny of M. persicae were found dead on the resistant plants. These results indicate that ACA gene should be an effective aphid-resistant gene and could be valuable for application in crop breeding for aphid resistance.     

农杆菌介导的转谷氨酰胺合成酶基因小麦的抗除草剂特性研究

 谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS,E.C. 6.3.1.2）是植物氨同化过程中的关键酶,对植物的氮素吸收和代谢起着至关重要的作用。谷氨酰胺合成酶还是除草剂草胺膦(Phosphinothricin　(PPT)或Basta)的靶标酶。前期工作已从我国特有的豌豆(Pisum satium)品种中克隆了细胞质型谷氨酰胺合成酶（GS1）cDNA和叶绿体型谷氨酰胺合成酶（GS2）cDNA。为了验证谷氨酰胺合成酶的功能,构建了同时含有GS1 cDNA和GS2 cDNA的植物表达载体p2GS。以该表达载体通过农杆菌介导法,转化小麦(Triticum aestivum)的未成熟胚愈伤组织,经PPT筛选及分化再生培养,获得了抗PPT的转基因小麦植株41株。PCR和基因组Southern 杂交分析证实了GS1 和GS2基因已经整合到转基因小麦的基因组。用除草剂草胺膦Basta溶液涂抹转p2GS小麦叶片,结果证明GS转基因植株可以抗高达0.3%的 Basta溶液,而对照植株叶片逐渐变黄直至枯死。转基因小麦植株能正常结实。上述实验结果表明：1) GS基因在小麦植株中获得了有效表达,从而赋予小麦植株抗PPT特性;2) GS基因能够作为研究小麦遗传转化的筛选标记基因。     

Arresten在烟草中的表达及其生物学活性分析

采用5'端引入His-tag的引物从携带有Arresten基因的质粒pCA中扩增血管生成抑制因子Arresten编码基因,构建其植物表达载体pCAMBIAarr并通过冻融法转化根癌农杆菌LBA4404,获得携带目的基因的重组农杆菌.采用叶盘法以重组农杆菌转化烟草,在50 μg/mL潮霉素B为选择压力下获得再生烟草植株,经过Southern杂交、RT-PCR和Western blotting检测,获得稳定整合有Arresten编码基因的烟草转基因植株.牛血管内皮细胞BCE增殖抑制实验表明,采用镍离子螯合次氨基三乙酸亲和层析法从转基因烟草叶片中分离纯化的重组Arresten蛋白具有明显的抑制牛血管内皮细胞增殖的生物活性.     

Biochemical and phenotypical characterization of transgenic tomato plants overexpressing a basic peroxidase

Tomato plants ( Lycopersicon esculentum Mill. cv. Pera) were transformed via Agrobacterium tumefaciens with the binary vector pKYLX71 containing a tomato basic peroxidase (EC 1.11.1.7) gene, tpx1 , under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV35S) promoter. Transgenic plants showed a 2–5-fold increase in the activity of the peroxidase ionically bound to the cell wall, whereas soluble peroxidase activity remained similar or even lower than wild-type plants. Isoelectric focusing showed the presence of a new isoperoxidase of pI ca 9 in the ionically bound extract. Western blot also showed the presence of a new band at 41 kDa that was absent in the wild-type extract. A 40–220% increment of lignin content of the leaf was found in transgenic plants. Shoot phenotype of transgenic plants was similar to wild type, although under stress, the plants appeared wilted and the new leaves had a reduced area and were thicker than wild-type or older transgenic leaves. The root system was underdeveloped in transgenic plants, but the rooting ability of the stem was not affected by the overexpression of peroxidase. Finally, the morphogenetic response of cotyledon and hypocotyl explants from transgenic plants was evaluated. In the case of cotyledons, the percentage of explants with shoot was not different from wild-type plants. For hypocotyl, one of the transgenic lines showed a 30% reduction in the percentage of shoot organogenesis. The results are discussed in relation to the role of tpx1 in lignin synthesis.