植物基因打靶技术

基因打靶是反向遗传学的基础工具,它通过同源重组置换染色体内的基因用于复杂基因组的基因功能分析。但是,在植物中,外源DNA的插入主要是非序列依赖的非同源末端连接方式,基因打靶频率很低,只有10-5～10-4的水平。综述了近年来为了提高植物基因打靶频率,研究人员的工作和最新进展 。     

植物的基因打靶

对拟南芥、苔藓等几种模式植物基因打靶的研究新进展作了概述,并对目前基因打靶领域的一些新技术(如含有重组酶和稀有限制性内切酶的基因打靶载体技术、异源重组基因的过表达技术、参与重组酶的基因突变技术、寡核苷酸诱导的基因打靶技术等)作了介绍.     

Modification of Endogenous Natural Genes by Gene Targeting in Rice and Other Higher Plants

The capability to modify a genomic sequence into a designed sequence is a powerful tool for biologists and breeders to elucidate the function of an individual gene and its cis-acting elements of multigene families in the genome. Gene targeting refers to the alteration of a specific DNA sequence in an endogenous gene at its original locus in the genome. In higher plants, however, the overwhelming occurrence of the random integration of transgenes by non-homologous end-joining is the main obstacle to develop efficient gene targeting. Two approaches have been undertaken to modify a genomic sequence in higher plants– chimeric RNA/DNA oligonucleotide-directed gene targeting to generate a site-specific base conversion, and homologous recombination-dependent gene targeting to produce either a base change or a gene replacement in a sequence-specific manner. The successful and reproducible targeting of an endogenous gene by homologous recombination, independently of gene-specific selection by employing a strong positive-negative selection, has been demonstrated for the first time in rice, an important staple food and a model plant for other cereal species. This review addresses the current status of targeting of an endogenous natural gene in rice and other higher plants and discusses possible models for Agrobacterium- mediated gene targeting by homologous recombination using a strong positive–negative selection.     

植物基因打靶研究进展

植物基因打靶研究的重心在于研究如何使基因打靶成为植物基因操作的常规手段。近年来科学工作者在这一领域取得了突破性进展,这些成就主要依托锌指核酸酶,染色质重建蛋白以及正负选择的应用。对上述成果进行综述,并对其发展趋势进行展望。     

基因打靶技术的研究进展

基因打靶技术是一项新兴的分子生物学技术,是利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组,并整合在预定位点上,从而改变细胞遗传特性的方法。它的产生是遗传工程领域的一次革命,为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究手段。目前基因打靶技术在研究基因的结构和功能、表达与调控,转基因及基因治疗等方面均取得了进展。但基因打靶技术仍存在一些问题,主要是打靶的效率太低。本文综述了基因打靶技术的原理、操作程序并对提高基因打靶效率的可能途径进行了探讨。 Progress on Gene Targeting LIU Hong-quan1,DAI Ji-xun1,YU Wen-gong2,YANG Kun-feng1 1.Ocean University of Qingdao,College of Marine Life Sciences,Qingdao 266003,China; 2.Institute of Marine Drugs and Foods,Qingdao 266003,China Abstract:Gene targeting is a rising technology in molecular biology,which is defined as the introduction of exogeneous DNA to specific site in genome by homologous recombination,and consequently change the hereditary character of the cell.This technology provides a new and powerful means for research in developmental biology,molecular genetics,immunology and medicine.Progresses have been made in exploring gene structure and function,gene expression and regulation,transgene and gene therapy with the application of gene targeting.But there are some problems in gene targeting,especially for the low efficiency.This article just provided a review of the principle and program of gene targeting,and discussed the possible approaches to increase the efficiency of gene targeting. Key words：gene targeting;homologous recombination;targeting vector;targeting efficiency     

真核生物中基因打靶的策略

本文综述了真核生物中应用较为广泛且较为有效的基因打靶策略,并且比较了这几种策略的优缺点,对新近发展起来的组织特异性基因打靶和可诱导的基因打把策略也作了介绍在打靶在人类遗传病动物模型的构建,基因治疗和基因功能研究方面都有着重要的作用。     

肿瘤基因治疗的靶向策略

对肿瘤组织的靶向性可以提高基因治疗的效果 ,避免对正常组织的损伤 ,并且能降低作为载体的微生物对机体的危害。对于瘤内注射的给药方法 ,靶向性似乎显得不是特别重要 ,但是如果要系统给药 ,靶向性是很关键的一个问题。靶向基因治疗肿瘤可以通过靶向基因导入和靶向基因表达来实现。近年来 ,在靶向基因导入方面的研究有很多进展 ,例如 ,用双亲性的桥连分子协助腺病毒和逆转录病毒靶向转导 ;在各种病毒载体的衣壳蛋白中插入靶向性的小肽或较大的多肽靶向结构域 ;增殖病毒作为一种很有前途的抗肿瘤制剂可有效地靶向杀伤肿瘤细胞。受体介导的DNA或DNA 脂质体复合物的靶向系统和其他一些靶向性的有疗效的载体 ,如细菌 ,也处于研究中。其中的一些载体已经进入临床实验。为了实现基因的靶向可调控表达 ,组织或肿瘤特异性的启动子和人工合成的可调控表达系统被用来调控治疗基因的表达。反义核酸、核酶以及脱氧核酶 (DNAzyme)被用来靶向抑制与肿瘤发生密切相关基因的表达。     

基因打靶及其应用

用活细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质,达到定点修饰改造染色体某基因的目的,此法称基因打靶．基因的同源重组是较普遍的生物现象,其分子机理尚未阐明,但活细胞内确有一酶系可使DNA的同源序列在细胞内发生重组,这一事实已无可争辨．此事实为基因打靶的理论基础．基因打靶技术操作的关键是建立一含筛选基因的重组载体,并有效地把它转入细胞核内．基因打靶命中的细胞可稳定遗传．基因打靶在改造生物品种,一些复杂生命现象（如发育的分子机制等）及临床理论研究均有广阔的前景．     

基因打靶技术在模式植物小立碗藓的应用

介绍了基因打靶技术在新型模式植物小立碗藓(Physcomitrella patens)中的应用.     

基因定点整合技术及其在苔藓研究中的进展

基因定点整合技术是20世纪80年代后兴起的一种分子生物学技术,在精细研究基因功能,消除转基因沉默,基因治疗等有重要意义。基因定点整合技术是功能基因组学研究的重要手段。目前关于基因定点整合技术在酵母和鼠胚胎干细胞中的应用已经很成熟,高等植物由于同源重组频率较低而限制了它的应用,但小立碗藓(Physcomitrella patens)基因同源重组频率较高,基因定点整合技术得到了成功应用,可望成为一种新的分子生物学的模式植物。本文针对基因定点整合的原理、技术路线及进展作一综述。     

植物基因打靶效率的研究进展

基因打靶技术是将外源DNA定向整合入基因组中对特定基因进行精确修饰,从而改变生物遗传性状的技术。它在特定基因功能研究、遗传育种和生理机制的理解方面有着重要意义,但植物中较低的基因打靶效率制约着它的进一步推广和应用。本文着重从载体构建、筛选策略、受体细胞状态等方面对打靶效率的提高进行分析,并介绍同源重组酶系、锌指核酶和寡核苷酸技术在基因打靶中的应用。     

基因定点整合技术及其在苔藓研究中的进展

基因定点整合技术是20世纪80年代后兴起的一种分子生物学技术,在精细研究基因功能,消除转基因沉默,基因治疗等有重要意义。基因定点整合技术是功能基因组学研究的重 要手段。目前关于基因定点整合技术在酵母和鼠胚胎干细胞中的应用已经很成熟,高等植物 由于同源重组频率较低而限制了它的应用,但小立碗藓（Physcomitrella patens）基因同源重组频率较高,基因定点整合技术得到了成功应用,可望成为一种新的分子生物学的模式植物。本文针对基因定点整合的原理、技术路线及进展作一综述。     

植物基因打靶技术及其应用

本文对植物基因打靶技术的原理、操作程序、打靶效率的影响因素及其在植物中的应用现状进行了综述,并就如何有效的提高打靶效率提出了建议,同时对该技术在植物学研究领域中的应用前景进行了展望。     

基因打靶技术的研究进展

基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(ES细胞)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的试验手段,具有广阔的应用前景。对基因打靶技术原理、步骤、条件性基因打靶以及应用进行综述。     

p35Nck5a基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复,采用常规的分子克隆技术,构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞,经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择,获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆,细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复,同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。     

植物基因打靶研究现状

基因打靶是八十年代后期发展起来的一门新兴的遗传工程技术,基因打靶技术在探索生物的基因功能,消除转基因的沉默,提高转基因的稳定性和表达效率以及基因治疗等方面均取得了进展。基因打靶技术的应用前景广阔,它的产生是遗传工程领域的一次革命。目前,基因打靶在植物上的应用研究才刚起步。本文针对基因打靶在植物上的研究现状作一综述。     

影响动物细胞同源重组发生与基因打靶效率的分子机制

真核细胞的基因打靶是基因结构与功能研究的一种非常有价值的技术,也是可应用于基因治疗的具有潜力的工具。有2个限制因素束缚真核细胞基因打靶的发展,即同源重组(HR)率非常低而随机整合率非常高。通过特定基因的过表达或表达干涉,使一些参与DNA重组的蛋白表达水平瞬间改变,可能会增加HR率,降低随机整合率。本文列举了一些与HR相关的候选基因,详细介绍了其中的Rad52上位簇基因,还讨论了打靶载体的设计与修饰、DNA转染方法的有效性等。     

绵羊Myostatin基因敲除载体的构建

根据Myostatin基因突变可导致肌肉量激增而产生"双肌"表型的特点,构建绵羊Myostatin基因置换型敲除栽体.利用LA-PCR技术成功地扩增得到绵羊Myostatin基因同源臂序列,其中同源长臂4.9kb,包括全部的exonl,intronl,exon2及部分启动子和大部分intron2;同源短臂1.1kb,包括部分exon3和31非翻译区序列,将二者连入PloxpⅡ正负筛选敲除骨架载体,利用骨架载体上Neo基因替代Myostatin基因的exon3,从而成功构建专门针对Myostatin第3外显子区域缺失的置换型敲除载体PloxpⅡ-OVIS-MSTN.酶切和测序鉴定证明载体构建正确,为后续获得绵羊Myostatin基因缺失型体细胞株奠定试验基础.     

基因靶位操作的原理与策略

基因靶位操作(gene targeting)是80年代发展起来的一项重要分子生物学技术, 是通过外源DNA与染色体DNA间的同源重组,定点修饰、改造基因组特定位点的技术.