表达霍乱CT-B和LPS-O抗原的鼠伤寒菌苗株的构建

将编码霍乱ＣＴ－Ｂ和ＬＰＳ－Ｏ抗原的基因与载体质粒ｐＹＡ２４８重组后,转入△ｃｙａ△ｃｒｐ△ａｓｄ减毒鼠伤寒疫苗株ｘ４０７２构建成无药物抗性,带双价抗原的工程菌株ｘ４０７２（ｐＭＧ３０６）。该菌株能分泌表达特异的霍乱ＣＴ－Ｂ抗原,并且在菌体表面同时表达霍乱和鼠伤寒的Ｏ抗原。小鼠腹腔免疫和攻击试验表明该菌株对霍乱毒株的攻击具有良好的保护作用。本研究为新型献计霍乱／鼠伤寒双价口服活疫苗的构建打下了基础     

宋内Ⅰ相抗原和霍乱CT-B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)I相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio choler-ae)的CT-B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248,得重组质粒PMGL105。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏菌X4072,构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死系统。一系列实验表明,该重组菌X4072(PMGL105)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原。小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

霍乱cT-B和LPs-o双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒紊B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GMl一ELlsA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱cT—B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的0抗原,它的脂多糖O抗原通过sDS-PAGE电泳分析．显示它表达了霍乱LPs的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明．有良好的保护作用．因此1046(pMG30s)可望成为霍乱活疫苗的候选株。     

霍乱cT-B和LPs-o双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒素B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GM1-ELISA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱CT-B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的O抗原,它的脂多糖O抗原通过SDS-PAGE电泳分析,显示它表达了霍乱LPS的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明,有良好的保护作用,因此1046(pMG305)可望成为霍乱活疫苗的候选株。     

宋内I相抗原和霍乱CT—B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)l相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的CT—B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248．得重组质粒PMGLl05。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏茵X4072．构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死景统。一系列实验表明．该重组苗X4072(PMGLl05)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原．小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

表达大肠杆菌LT—B抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

采用无毒的鼠伤寒沙门氏菌sR一1l△Cya,△Crp,△asd菌株作为宿主菌,选择相应的asd+表达载体构建了含大肠杆菌肠毒素B亚基基因(toxB)的重组质粒,并通过两次转化引入宿主菌,构成了平衡致死的重组体。特异性的测定表明,这种无抗药性的杂合菌株能较高水平地表达LT—B抗原,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗的研究基础。     

鼠伤寒杆菌主要外膜蛋白作为保护性抗原的研究

采用超声破碎,ＴｒｉｔｏｎＸ─１００处理和Ｓｅｐｈａｃｒａｌ超细Ｓ─３００凝胶过滤技术提取了鼠伤寒杆菌的主要外膜蛋白（ＭＯＭＰｓ）。ＭＯＭＰｓ的脂多糖（ＬＰＳ）含量约为０．２％。经ＳＤＳ─ＰＡＧＥ图谱显示蛋白在３６─４１ＫＤ之间。ＭＯＭＰｓ能使小鼠产生典型的足垫肿胀（ＤＴＨ）及高水平的ＩＬ─２;可保护５００ＬＤ５０鼠伤寒杆菌及伤寒杆菌的攻击,其免疫保护率分别为９０％和３３．３％,用５０ｕｇＭＯＭＰｓ免疫的小鼠的Ｔ淋巴细胞经尾静脉注射给非免疫小鼠,可使后者得到被动免疫保护,其保护率为４２．９％。基于上述实验结果,本文认为鼠伤寒杆菌的ＭＯＭＰｓ是一良好的保护性抗原。     

表达大肠杆菌LT-B/ST融合抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

编码LT-B/ST融合抗原的基因插入pYA248载体中,构建了重组质粒pXZL66。该重组质粒转入无毒鼠伤寒沙门氏菌SR-11,ΔCya,Δcrp,Δasd菌株X4072。此无抗药性的杂合菌株X4072(pXZL66)表达的LT-B/ST融合抗原具有LT和ST抗原性而没有生物毒性,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗候选株。     

预防幼畜腹泻双价工程菌苗株的构建及表达

Bam HI部分酶切表达K99抗原的重组质粒pMGK99,将其与相同酶切的含有F41菌毛基因的片段相连接,构建了载有两种抗原基因的质粒pMG611。通过转化大肠杆菌K12HB101、RRI和c600,得到HBlOl(pMG611)、RRl(pMG611)和C600(pMG611)菌株。经甘露糖抗性血凝试验、玻片凝集试验和western blot分析证明K99和F4l两种菌毛抗原在每株菌中均获表达。sDs—PAGE结果表明所表达K99和F4l菌毛亚单位的分子量与其各自野生株所产生的相同,分别是17200和29800Da,ELIsA测定HB101(pMG611)菌株表达K99和K41菌毛抗原的水平与相应出发菌株相同,而高于其野生株。本实验对质粒pMG611表达K99和F41菌毛抗原的影响因素也进行了研究。     

减毒鼠伤寒沙门菌三型分泌表达系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活疫苗载体,本研究以pYA3493质粒为基础,用鼠伤寒沙门菌sopE_(Nt100)基因及其启动子替代原有的P_(trc)启动子,构建沙门菌三型分泌表达载体pYA-sopE_(Nt100);再将质粒pYA-sopE_(Nt100)电转入沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,构建减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因egfp克隆入sop E基因下游,构建重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100)-egfp),感染Vero细胞,用Western blotting分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株Δcrp SL1344及野生株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢;重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))的LD50较野生株SL1344降低了7.0×104倍;Western blotting结果发现,重组菌培养上清中能检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da);重组菌株感染Vero细胞后,可以同时检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da)和EGFP蛋白(27 k Da)。以上结果证实,本研究成功构建了新型减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

鼠伤寒沙门氏菌SL7207 SifA-突变株的构建和鉴定

鼠伤寒沙门氏菌SifA^-基因突变株的特点是能进入真核细胞的胞液。利用P22噬菌体转导技术构建了鼠伤寒沙门氏菌疫苗株SL7207的SifA^-突变株SL7207,该突变株与SL7207有着相似的体外生长曲线和细胞侵袭力,SL7207。在MDCK上皮细胞中的增殖能力增强,但在RAW264．7巨噬细胞中的生存能力减弱。小鼠毒力试验显示SL7207。在BALB／c小鼠体内毒力下降。仅SL7207在体外可向RAW264．7巨噬细胞递送真核表达质粒。SL7207的构建为重组沙门氏菌疫苗载体的研制提供了一个新的选择。     

鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株的构建及其耐药性

[背景]鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种重要的人兽共患病原菌,其多重耐药性问题日益严重,双组分系统可调控鼠伤寒沙门氏菌的耐药性。[目的]通过构建鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株及回补株探究BaeSR双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。[方法]在BaeSR双组分系统和AcrB外排泵双缺失株（CRΔbaeSRΔacrB）的基础上构建baeR过表达株（CRpbaeRΔbaeSRΔacrB）及baeR回补株（CRcbaeRΔbaeSRΔacrB）,测定双缺失株、回补株和过表达株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并对其生长特性、生物膜形成能力及运动性进行分析。采用转录组学技术筛选与耐药相关的差异表达基因,RT-qPCR验证耐药相关基因。[结果]构建了鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株和baeR回补株。与双缺失株相比,过表达株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、乙酰甲喹、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林和氨苄西林的MIC分别升高2-256倍,对大观霉素、安普霉素的MIC下降了50%;与双缺失株相比,回补株对头孢他啶...     

鼠伤寒沙门氏菌SL7207SifA-突变株的构建和鉴定

鼠伤寒沙门氏菌SifA-基因突变株的特点是能进入真核细胞的胞液。利用P22噬菌体转导技术构建了鼠伤寒沙门氏菌疫苗株SL7207的SifA-突变株SL7207*,该突变株与SL7207有着相似的体外生长曲线和细胞侵袭力,SL7207*在MDCK上皮细胞中的增殖能力增强,但在RAW2647巨噬细胞中的生存能力减弱。小鼠毒力试验显示SL7207*在BALB/c小鼠体内毒力下降。仅SL7207*在体外可向RAW2647巨噬细胞递送真核表达质粒。SL7207*的构建为重组沙门氏菌疫苗载体的研制提供了一个新的选择。     

鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

表达幽门螺杆菌黏附素保守区的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

为构建表达幽门螺杆菌（Hp）黏附素保守区（AB）的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,采用缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因（Δasd）的鼠伤寒沙门菌（X4072）作为宿主,将编码AB的基因插入Asd⁺的组成型表达载体pYA248,通过两次转化引入宿主菌,构建了表达AB基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4072（pYA248-AB）,采用桥联法ELISA测定X4072（pYA248-AB）培养上清液和裂解上清液中AB的抗原性,参照Meacock叙述的方法及重组菌生长曲线的测定来确定重组菌株的稳定性,通过C57BL/6小鼠口服测定半致死量来确定重组菌的安全性。成功构建了表达AB的减毒鼠伤寒沙门菌重组菌株S.typhimurium X4072(pYA248-AB),桥联法ELISA测定表明重组菌X4072（pYA248-AB）培养上清中AB的含量高于菌体裂解液,重组菌pYA248-AB在没有选择压力的情况下培养100代,随机挑选的重组菌全部都能生长,且在ELISA测定AB抗原时均显阳性。重组菌的生长曲线测定表明,X4072（pYA248）和X4072（pYA248-AB）的生长状态基本一致;口服重组菌株X4072(pYA248-AB)1.0×10¹⁰cfu.30d后,C57BL/6存活率仍为100%。成功构建了表达AB的无抗性的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗X4072（pYA248-AB）,体外实验表明重组质粒是稳定的,动物实验证明重组菌株是安全的;为防治幽门螺杆菌感染提供了口服活菌疫苗候选株。     

伤寒-鼠伤寒重组株Vi4072在小鼠中定居及血清学效果观察试验

将编码Vi抗原的基因克隆到减毒的鼠伤寒沙门氏菌中组建的基因重组株Vi4072,以3×10~8CFU一次口服感染Balb/C小鼠,4天后按7,14,21,28,35,42,49,56,63,70天的间隔收集分离小鼠的集合淋巴结,肝,脾.鉴别是否有本菌出现,并检测血清和小肠匀浆液中的vi抗体.结果表明,感染后49天仍可从脾中分离到该菌;70天仍可从血清和小肠匀浆液中测出vi抗体。     

两株无鞭毛鼠伤寒菌的微生物学诊断

两株无鞭毛鼠伤寒菌的微生物学诊断席连香（济南市卫生防疫站,２５００１８）不典型变异的沙门氏菌检验是一项非常细致的工作,我们在腹泻病人微生物学调查中发现了两株无鞭毛沙门氏菌,经过一系列细致的鉴定,证实为鼠伤寒沙门氏菌。一材料工沙门氏菌因子血清卫生部上海...