一株产生淀粉酶杆菌Bacillus sp. GEL-09的筛选、鉴定及发酵条件优化

【背景】生淀粉酶可以水解生淀粉颗粒,在酒精发酵、白酒、黄酒和食醋的生料酿造工业中具有广阔的应用前景。【目的】从自然环境中筛选产生淀粉酶的菌,对其发酵条件及酶性能进行考察,为淀粉生料发酵过程提供优良菌种和酶资源。【方法】取木薯田土壤,经过稀释、热处理、富集培养以及木薯淀粉平板筛选培养基初筛,摇瓶复筛得到产高效降解生淀粉酶的菌株;经过菌落形态、细胞染色观察以及16S rRNA基因序列比对进行鉴定;对筛选菌株的发酵培养基和发酵条件进行优化,并对酶蛋白进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】分离到一株具有较高生淀粉酶水解活力的菌株GEL-09,经鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp.GEL-09;该菌在最优发酵条件下培养96 h,胞外酶活力达到430.6 U/m L,是优化前的2.8倍;酶学性质分析发现该酶为中温、中性酶,最适温度和p H为50°C和7.0;生淀粉降解能力对比发现,该酶的生淀粉降解能力值为62.3%,显著高于细菌α-淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶和甘薯β-淀粉酶对生淀粉的降解能力。【结论】Bacillus sp.GEL-09在生淀粉酶生产方面具有良好的开发应用前景。     

α-淀粉酶AmyP中淀粉结合结构域的鉴定

【目的】检测具有生淀粉降解活性的新型α-淀粉酶AmyP是否具有淀粉结合结构域(SBD)。【方法】通过结构域预测和序列分析, 推测AmyP的C端是一个SBD。将这段序列克隆、表达和重组蛋白纯化后, 采用亲和电泳和生淀粉吸附两种方法对重组表达的蛋白进行研究。【结果】AmyP的C端序列是一个新型的SBD, 根据序列特征可以将其划分在碳水化合物结合结构域(CBM) 20家族。该SBD与生大米淀粉的吸附能力最强, 生玉米淀粉次之, 不能与生小麦淀粉、生马铃薯淀粉和生绿豆淀粉吸附。【结论】α-淀粉酶AmyP在蛋白C端具有一个SBD, 有助于理解AmyP快速偏好性降解生淀粉的能力。     

淀粉结合域与α-淀粉酶的融合表达及其酶学性质

利用RT-PCR从Rhizopus oryzaeGX-08总RNA中克隆到糖化酶的淀粉结合域(SBD)基因(sbd),将该基因片段插入α-淀粉酶(CN7A)基因cn7a的5′端构建融合表达质粒pSE-sbdcn7a。嵌合酶SBD-CN7A在Escherichia coliJM109表达,并经Ni-NTA、Sephacryl S300纯化。酶学性质研究表明:嵌合酶在最适作用条件方面与原始酶并无明显差别;在以生玉米粉为底物时,其比酶活提高了8.7倍,而以可溶性淀粉为底物时其比酶活是原始酶的1.8倍,Km也从3.784 g/L降低为2.234 g/L;嵌合酶在65℃下的半衰期从10 min缩短为4 min。结果表明,淀粉结合域SBD的融合赋予了α-淀粉酶CN7A水解生淀粉的能力。     

黑曲霉突变株分解生淀粉的葡萄糖淀粉酶的提纯及其…

黑曲霉突变株Ｔ－２１产生的葡萄糖淀粉酶具有多型性,在凝胶电泳上呈现很多蛋白质带,酶活力显色表明许多条（５条以上）均表现出淀粉酶活力,酶制剂浸出液通过硫酸铵分级沉淀,ＤＥＡＥ－纤维素柱层析,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０柱凝胶过滤和ＤＥＡＥ－纤维素柱再层析分离纯化到了一型能被生淀粉吸附和水解生淀粉的葡萄糖淀粉酶ＧＡＩ和用凝胶制备电泳分离纯化到一型既不为生淀粉吸附又不水解生淀粉的ＧＡＩＩ。ＧＡＩ被生小麦     

草酸青霉转录因子POX03446对生淀粉酶产量调控的初步研究

生淀粉酶可以在淀粉糊化温度以下的温度下直接降解生淀粉,具有巨大应用价值。丝状真菌生淀粉酶的产生受转录因子的严格调控。但是,草酸青霉(Penicillium oxalicum)中生淀粉酶产生的调控机制仍不清楚。前期工作中,通过比较基因组学获得了草酸青霉HP7-1中调控生淀粉酶产量的候选调控基因集。本研究以草酸青霉ΔPoxKu70为出发菌株,用同源重组技术敲除了其中一个候选调控基因POX03446,获得了缺失突变株ΔPOX03446。在可溶性淀粉培养条件下,与出发菌株ΔPoxKu70相比,转接后第2天,ΔPOX03446的生淀粉酶产量显著下降29.8%~40.3%(p<0.01;Student’s t test);转接后第4天,生淀粉酶产量显著下降14.6%~29.7%(p<0.01;Student’s t test),表明基因POX03446正向调控草酸青霉生淀粉酶的产生。NCBI BlastP比对分析显示POX03446与草酸青霉调控木聚糖酶基因和纤维素酶基因表达的转录因子PoXlnR一致性为46%。这是第一次报道POX03446调控草酸青霉生淀粉酶的产生。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。Β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

大曲来源淀粉利用型乳酸菌的筛选及其淀粉利用特性

【背景】乳酸菌是面包、馒头等发酵食品中的重要功能微生物,对改善质地和风味均具有重要作用。淀粉利用能力高的乳酸菌,因其能够在生面粉中更好地定殖而具有重要的应用价值。【目的】筛选获得淀粉水解型乳酸菌并研究其淀粉利用特性。【方法】以浓香型白酒大曲为筛选源,采用淀粉基质碳源对大曲中乳酸菌进行定向富集,结合淀粉发酵能力筛选高淀粉利用能力菌株,并对筛选得到的优良菌株展开淀粉酶表达及其酶活力研究。【结果】以贮存3-6个月的大曲为优秀筛选源,以生面糊传代富集方法可较快筛选出具有良好淀粉利用能力的乳杆菌,主要物种为植物乳杆菌和类食品乳杆菌。对其中一株具有淀粉利用能力的类食品乳杆菌LBM12001的淀粉水解特征和淀粉酶活力展开研究,该菌株淀粉水解能力达10 g/L,并且其在面糊中具有良好的定殖能力;酶活力测定表明,其α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶为胞外酶;麦芽糖淀粉酶水解淀粉的最适pH值为3.5,比酶活为1 240 U/mg。【结论】建立起从我国传统白酒发酵大曲中高效筛选淀粉水解型乳酸菌的富集筛选方法,以及菌株的水解能力评价方法,获得的胞外麦芽糖淀粉酶分泌型乳杆菌在酸面团、馒头等需进行生面粉发酵食品的生产中具有重要应用前景。     

生淀粉酶生产菌株Paenibacillus sp.的筛选和酶的纯化及酶学性质

分离得到1株产生淀粉酶的菌株,通过扩增和测定16S rDNA序列并进行比对,发现是Paenibacillus属的细菌。液体摇瓶发酵结束后,其产生的生淀粉酶比酶活达108.5U/mL。通过饱和(NH4)2SO4沉淀、Sephacryl S-300层析的方法对其所产的生淀粉酶进行分离纯化,得到纯化的酶蛋白比酶活为5112.04U/mg,纯化倍数为14.1,相对分子质量约为1.0×105。该酶以木薯生淀粉为底物时,最适pH5.6,最适温度50℃。金属离子Ca2+、Mg2+对该酶具有激活作用,Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Mn2+、Co2+和EDTA2-对该酶均具有抑制作用。     

融合淀粉酶AmyP-Clo对大米生淀粉的高效降解

【目的】获得能高效降解大米生淀粉的α-淀粉酶。【方法】将来源Clostridium butyricum T-7的α-淀粉酶的淀粉结合结构域与能快速偏好性降解大米生淀粉的α-淀粉酶Amy P的催化结构域融合重组表达。【结果】融合蛋白Amy P-Clo保留了野生型Amy P催化优势的基础上,对大米生淀粉的比活为(373.9±8.4)U/mg,4 h内对5%大米生淀粉的最终降解率为(42.7±1.1)%,对大米生淀粉的最高结合率为(71.1±1.6)%,这些数据相比Amy P分别提高了3.1、2.8和1.3倍。【结论】融合蛋白Amy P-Clo能高效降解生大米淀粉,是一个具有优良应用价值的酶。     

急性早幼粒细胞白血病患者小孢根霉变种感染1例

报道1例由小孢根霉变种导致的皮肤毛霉病.患者女,30岁.因患急性早幼粒细胞白血病,化疗后继发口腔颌面部小孢根霉变种感染,表现为发热、右侧颊黏膜水肿,皮损中央溃疡、焦痂,周边组织炎性水肿,以面颊部、颌下区为中心明显肿胀,逐渐累及右侧颈部及右下颌,进行性加重.坏死组织涂片镜检显示有粗大、无分隔直角菌丝,真菌学检查鉴定为小孢根霉,分子测序证实为小孢根霉变种.给予两性霉素B、伊曲康唑静脉滴注和手术清创,坏死组织连续3次真菌培养均未培养出小孢根霉变种,患者体温逐渐恢复正常,治疗2周后颔面部肿胀明显减退,浅表淋巴结未触及肿大,4周后额部及右眼睑肿胀已完全消退,伤口结痂愈合.随访2 a,右侧颌下可见长约2 cm手术疤痕,未见皮肤毛霉病复发.     

华根霉合成活性脂肪酶液态发酵菌体形态调控的研究

华根霉(CCTCC M201021)膜结合脂肪酶在非水相中具有突出的催化酯合成的能力,在生物香料、生物柴油生产等工业应用中具有良好的前景.与许多丝状真茵形态影响其初级及次级代谢产物的生产相类似,华根霉在液态发酵中也会形成不同的茵体形态,显著影响合成活性膜结合脂肪酶的发酵水平.本研究以华根霉菌体形态及脂肪酶合成活性为指标...     

Enhanced production of raw starch degrading enzyme using agro-industrial waste mixtures by thermotolerant Rhizopus microsporus for raw cassava chip saccharification in ethanol production

In the present study, solid-state fermentation for the production of raw starch degrading enzyme was investigated by thermotolerant Rhizopus microsporus TISTR 3531 using a combination of agro-industrial wastes as substrates. The obtained crude enzyme was applied for hydrolysis of raw cassava starch and chips at low temperature and subjected to nonsterile ethanol production using raw cassava chips. The agro-industrial waste ratio was optimized using a simplex axial mixture design. The results showed that the substrate mixture consisting of rice bran:corncob:cassava bagasse at 8?g:10?g:2?g yielded the highest enzyme production of 201.6?U/g dry solid. The optimized condition for solid-state fermentation was found as 65% initial moisture content, 35°C, initial pH of 6.0, and 5?×?10⁶ spores/mL inoculum, which gave the highest enzyme activity of 389.5?U/g dry solid. The enzyme showed high efficiency on saccharification of raw cassava starch and chips with synergistic activities of commercial α-amylase at 50°C, which promotes low-temperature bioethanol production. A high ethanol concentration of 102.2?g/L with 78% fermentation efficiency was achieved from modified simultaneous saccharification and fermentation using cofermentation of the enzymatic hydrolysate of 300?g raw cassava chips/L with cane molasses.     

华根霉脂肪酶有机相合成酶活的研究

通过比较7种微生物脂肪酶的有机相合成酶活、水相水解酶活及在正庚烷中催化己酸乙酯合成的能力,证明了合成酶活与水解酶活相关性不高,合成酶活比水解酶活更能反映脂肪酶的合成能力。通过比较两株华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶酶活,发现合成酶活相差较大,表明相同种属微生物的脂肪酶合成酶活存在不同。对．Rhizopus chinensis-2液态发酵产脂肪酶进程研究发现,水解酶活高峰先于合成酶活高峰大约12h。将不同培养时间的Rhizopus chinensis-2全细胞脂肪酶用于催化己酸乙酯合成,具有高合成酶活的全细胞脂肪酶催化己酸乙酯合成反应较快。因此,全细胞脂肪酶用于催化有机相酯合成反应时,具有高脂肪酶合成酶活的菌体具有较好的催化酯合成能力。     

安徽短萼黄连种群特性及其濒危机制探讨

对安徽省境内短萼黄连的地理分布、分布地自然概况及种群大小、分布格局、年龄结构等种群特性进行研究.结果表明,短萼黄连在安徽省主要分布于九华山、黄山、清凉峰和牯牛降等山区.其生境涉及林冠下和水沟边两种类型,均表现为阴湿、土壤疏松、呈酸性而富含有机质,要求光照荫蔽度平均达到70%以上,空气相对湿度70%～90%,土壤含水量在30%以上.现有短萼黄连种群均为高群集分布,年龄结构不合理,且多为小种群,表明种群已处于相对不稳定阶段.自然生境的严重破坏、成年植株的过度采挖对短萼黄连种群的生存构成严重威胁,是造成部分野生种群个体数量急剧减少的主要原因.     

中华猕猴桃若干株系的染色体数目

报道了中华猕猴桃１０个株系的染色体数目。所有株系均为２ｎ＝１１６,为四倍体。植物体被软毛,平均果重７１￣１００ｇ,果实开头圆形、椭圆形、扁圆形或圆锥形。原产地海拔５６０￣１０３５ｍ。     

中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)的组织培养

以栽培的中国水仙Narcissus tazetta var.Chinensis鳞茎为实验材料,采取“无液处理”的简捷方法获取外植体,并筛选出中国水仙离体鳞茎培养的最佳培养基。     

基于全基因组数据华根霉产真菌毒素分析

【目的】在对中国传统优势浓香型白酒产业中重要功能微生物华根霉菌株CCTCCM201021全基因组测序的基础上,以生物信息学的方法和手段主要针对真菌毒素的合成代谢途径及关键基因进行分析,考察微生物在食品工业应用中的安全性。【方法】应用Illumina平台Solexa测序技术对华根霉进行基因组测序,运用SOAPdenovo组装软件进行拼接,并进行一系列生物信息分析,考察根霉素、小孢根霉素及典型丝状真菌毒素代谢的主要途径及相关基因,包括PKS、NRPS与PKS-NRPS混合代谢途径;萜类化合物代谢和其他代谢途径等,判断华根霉是否具有产真菌毒素的潜在危害性。【结果】测序结果表明华根霉全基因组大小为45.70 Mb左右,GC含量为36.99%。通过基因预测软件分析得到基因17 676个,共注释基因13 243个。通过进化树与同源基因比较分析,与目前基因组测序完成的仅有的3株接合菌基因组相比,序列相似性普遍偏低,与华根霉存在较为显著的差异,但同源基因的相似性在60%左右。代谢分析表明,华根霉中仅存在较少聚酮合成、萜类化合物合成途径代谢基因,存在大量异源物质降解途径基因。【结论】华根霉基本不具备产目前已知的真菌毒素的关键基因或合成能力,可以认为其发酵产品是相对安全的。在酿造过程中,不仅可作为糖化菌,在混菌发酵时,对部分具有抑菌能力的抗生物质具有降解功能,是发酵工业中应用的相对安全的重要生产菌。     

<Emphasis Type="Italic">Rhizopus microsporus</Emphasis> var.<Emphasis Type="Italic"> rhizopodiformis</Emphasis>: a thermotolerant fungus with potential for production of thermostable amylases

The effect of several nutritional and environmental parameters on growth and amylase production from Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis was analysed. This fungus was isolated from soil of the Brazilian "cerrado" and produced high levels of amylolytic activity at 45°C in liquid medium supplemented with starch, sugar cane bagasse, oat meal or cassava flour. Glucose in the culture medium drastically repressed the amylolytic activity. The products of hydrolysis were analysed by thin layer chromatography, and glucose was detected as the main component. The amylolytic activity hydrolysed several substrates, such as amylopectin, amylase, glycogen, pullulan, starch, and maltose. Glucose was always the main end product detected by high-pressure liquid chromatography analysis. These results indicated that the amylolytic activity studied is a glucoamylase, but there were also low levels of -amylase. As compared to other fungi, R. microsporus var. rhizopodiformis can be considered an efficient producer of thermostable amylases, using raw residues of low cost as substrates. This information is of technological value, considering the importance of amylases for industrial hydrolysis.     

Rhizoferrin: A complexone type siderophore of the mocorales and entomophthorales (Zygomycetes)

The present investigation presents evidence that rhizoferrin, a novel polycarboxylate or complexone-type siderophore, originally isolated from Rhizopus microsporus, represents the common siderophore within the Zygomycetes. Thus, rhizoferrin could be detected by HPLC analysis in various families of the Mucorales, e.g., Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis, Mucor mucedo and Phycomyces nitens (Mucoraceae), Chaetostylum fresenii and Cokeromyces recurvatus (Thamnidiaceae), Cunninghamella elegans and Mycotypha africana (Choanephoraceae) and Mortierella vinacea (Mortierellaceae) and in Basidiobolus microsporus (Entomophthorales). The function of rhizoferrin as a siderophore in the fungus R. microsporus var. rhizopodiformis was demonstrated by time- and concentration-dependent uptake of [55Fe]-labelled rhizoferrin, yielding saturation kinetics with values of Km = 8 microM and V(max) = 1.2 nmol min-1 (mg dry wt)-1.