立止血的研制历史及其应用概况

立止血是从蛇毒中分离得到的 ,以止血作用为主的酶性制剂。其中含有两种成分 :巴曲酶(Batroxobin) ,亦称巴特罗酶 (Batroase)、爬虫酶(Reptilase) ,及微量的凝血因子 脂依赖性激活剂(Phospholipid- depending Factor X Activator,FXA,简称 因子激活物 ) [1] 。因为前者在立止血中占绝大比例 ,我国也将巴曲酶、巴特罗酶、爬虫酶称为立止血 ,特别是将 Reptilase译 /称为立止血最为常见。比较正式的立止血药用通名应为血凝酶(Haemocoagulase) [1,2 ]。由于它具有速效、高效、长效、安全、方便且不受血浆凝血酶抑制剂影响的诸多优点 ,因…     

重组定点突变巴曲酶酶学性质研究

目的对重组定点突变巴曲酶的酶学性质进行研究,为开发成临床用药奠定基础。方法测定不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响。结果重组定点突变巴曲酶的最适pH值在6．5～7．5之间。该酶在50℃以下活力保持90％以上,但当温度超过60℃时,该酶已完全失活。Ca^2＋和Na^＋离子对酶的稳定性无明显影响,而Mg^2＋、K^＋、Mn^2＋离子则表现为激活作用,Zn^2、＋Cu^2＋、Fe^2＋、Co^＋离子则表现为明显的抑制作用。结论重组定点突变巴曲酶在中性条件下比较稳定,它不耐高温,金属离子对其活性有一定的影响。     

重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

以毕赤酵母为表达系统,建立生产重组巴曲酶的技术工艺路线。通过递归式PCR的方法,人工合成了巴曲酶基因,将其插入pPIC9表达质粒中,转化至毕赤酵母GS115(his4),筛选出的表达株经甲醇诱导,表达了重组巴曲酶,并得以纯化。从每升发酵液中可纯化得到10mg重组巴曲酶,其比活为238NIHunits/mg,分子量为30.55kD。重组巴曲酶在体外可使纤维蛋白凝固,在体内缩短小鼠出血时间。为开发重组的蛇毒类凝血酶止血剂打下了基础。     

重组定点突变巴曲酶质量标准研究

目的 建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准.方法 生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按<中华人民共和国药典>2010年版(三部)相关规定进行.结果 用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版<中华人民共和国药典>和相应指导原则的要求.三批原液比活性均≥2000 kU/mg.肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定.结论 建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定.     

巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

目的研究巴曲酶在毕赤酵母菌中的表达。方法按Pichiapastoris偏好密码子人工合成巴曲酶全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pPICZaA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入X-33。筛选鉴定转化子．经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的巴曲酶。经SDS-PAGE电泳确定其分子量为33．0 kDa．免疫印迹证明重组巴曲酶具有天然巴曲酶的免疫活性。结果经发酵条件的优化．发酵罐的表达量达到25000Ku／L发酵液。从每升发酵液中可纯化出11．0mg重组巴曲酶。结论巴曲酶毕氏酵母菌成功的构建．为重组巴曲酶止血药的开发奠定了基础。     

重组突变巴曲酶酶动力学及活性分析研究

目的对重组突变巴曲酶进行酶动力学初步研究,并建立一种蛇毒类凝血酶活性测定方法。方法使用可控温(37℃)紫外分光光度计,采用酶动力学测定法,测定重组突变巴曲酶的米氏常数,优化活性测定方法的反应时间和线性范围,验证此方法精密度,并用发色底物法与血浆凝集法同时测定不同蛇种来源的类凝血酶活性。结果重组突变巴曲酶的米氏常数(37℃)Km值为256.28μmol/L、Vm值为0.005 077μmol/min。该法呈现相应的剂量关系曲线,反应时间优选为0～20 min,线性范围优选为1～16.8 nmol/L,拟合度R~2≥0.99,方法精密度的变异系数≤5.0%。两种不同方法测定不同蛇种来源类凝血酶的活性单位比例范围为3.3～3.7(发色底物法/血浆凝集法),比例关系一致。结论建立的蛇毒类凝血酶活性测定方法拟合度优,精密度高,可测定不同来源的类凝血酶活性,并可替代传统血浆凝集活性测定法。     

天然巴曲酶的酶学性质研究

目的 研究巴西矛头蝮蛇蛇毒中纯化的天然巴曲酶的酶学性质.方法 测定不同的温度、pH值和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响.结果 实验表明,该酶在温度30～40℃,pH 6.5～9.0活性较为稳定;其最适反应温度为37℃,pH为7.5;Mg2+、K+和Ca2+离子对酶活有激活作用,而Cu2+、Fe2+和Zn2+离子对该酶有抑制作用.结论 从蛇毒提取的天然巴曲酶酶学性质比较稳定.     

地高辛标记探针检测重组定点突变巴曲酶蛋白宿主DNA残留量的研究

目的 建立检测重组定点突变巴曲酶原液中外源性DNA残留量的方法.方法 从重组定点突变巴曲酶酵母工程菌提取基因组DNA作为模板,制备地高辛标记探针.此探针与样品进行点样杂交,并进行显色反应.结果 3批重组定点突变巴曲酶原液中,每人份剂量的宿主DNA残留量均＜10 ng.结论 该方法检测灵敏度较好,特异性较强,可用于重组定点突变巴曲酶的检测.     

毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究

目的对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。方法通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。结果表达温度在25℃,pH值为7．0,加入甲醇的量为10g／L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84-96h。结论重组巴曲酶可以开发为止血药,代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。     

曲酸对飞蝗酚氧化酶以及其他生化酶活性的影响

酚氧化酶(Phenoloxidase)可以催化黑色素中间体多巴胺的形成,是昆虫黑化作用中的关键酶,在昆虫细胞免疫和体液免疫过程中发挥着重要的作用。"近年来,酚氧化酶成为新型杀虫剂靶标的研究对象之一,而酚氧化酶的抑制剂曲酸(Kojic acid)对昆虫解毒酶和保护酶的影响的研究却很少。为了探索酚氧化酶与昆虫其他解毒酶或保护酶类的关系,本文利用含不同剂量曲酸的麦麸饲喂飞蝗,检测飞蝗存活率以及虫体酚氧化酶(PO)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、解毒酶(ESTs和GSTs)和保护酶(POD、SOD和CAT)的活性。结果发现,曲酸对飞蝗无明显毒力;在曲酸处理1 d和3 d后,曲酸处理组飞蝗PO二酚酶活性显著低于对照,5 d和7 d后飞蝗PO活性与对照相比差异不大;处理3 d后,飞蝗AChE活性显著低于对照,而5 d后AChE相比于对照显著升高;偏高浓度的曲酸在1 d和3 d后对飞蝗ESTS和GSTs有显著的抑制,5 d和7 d后飞蝗ESTs和GSTs活性上升;曲酸在1 d和3 d后引起了飞蝗保护酶的升高,5 d后飞蝗保护酶有一定的下降。以上结果表明,曲酸对飞蝗PO有明显抑制作用,同时也干扰了昆虫其它生化酶的活性。由此推测,曲酸可以作为杀虫剂或者杀虫真菌的增效剂。     

立止血对家兔止血效果的研究

目的 观察立止血对家兔的止血效果,为该药的临床应用及研究类似产品提供可借鉴的资料。方法 测定家兔静注立止血前、后的因时间和凝血时间值,经统计学分析。结果 静沪立止血后所测不同时估（测至２４ｈ）的出血时间、凝血时间均经注药前自身空白对照缩短,具阶段性。结论 初步证实立止血具有高效、速效、长效、安全的作用特性,同时揭示立止血的止血功能具阶段性的特点。     

纤维素酶的固体培养方法

通过对菌株产酶能力的测定,确定了绿色木霉（Trichoderma viride)HWO7作为生产菌株。研究了培养基组成、培养条件和培养过程对产酶能力的影响,确定了固体培养生产纤维素酶的生产工艺。研究了纤维素酶的酶学特性。在确定工艺条件下,曲料的绝干酶活力（CMC－Na）达2605．1u/g,产品收率79．0％。     

定点突变巴曲酶在毕赤酵母中的克隆与表达

目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性.     

植物甲酸脱氢酶的研究进展

植物甲酸脱氢酶(FDH)是一种依赖NAD+的酶,它催化甲酸氧化成二氧化碳的可逆反应,是植物一碳代谢的一部分,在植物响应各种环境胁迫、低氧或缺氧过程中发挥着重要的作用。综述了植物FDH的生理作用、酶学特性及调控机制方面的研究进展。     

《植物生理学通讯》第41卷第1￣6期(总第227￣232期)总目录

专论与综述植物的钙调素亚型........刘曼毛国红孙大业(1):1黄瓜性别决定相关基因和性别表达机制...............................陈惠明卢向阳许亮等(1):7不定根形成与植物激素的关系.....................................王金祥严小龙潘瑞炽(2):133植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性................孙卫红王伟青孟庆伟(2):143生长素反应因子......吴蓓吴建勇蔡刘体等(3):273植物糖信号与激素信号之间的联系...................................陈俊伟谢鸣秦巧平(3):279植物功能基因组学研究技术及其在林木中的应用.....…     

植物顺乌头酸酶及其生理功能

介绍了植物顺乌头酸酶酶学特性、分子生物学及其生理功能的研究进展,对其在一氧化氮(NO)介导的植物抗病信号转导和NO、SA以及H2O2对话中的可能作用也作了概述。     

镰刀菌Q7-31T内切葡聚糖酶Egn21的分离纯化及酶学性质

【目的】为进一步研究镰刀菌Q7-31T产生的植物细胞壁降解酶的酶系信息。【方法】以1%(W/V)蛋白胨为氮源,0.5%(W/V)燕麦秸秆为碳源,20°C、120 r/min振荡培养3 d,诱导发酵培养菌株,获得的粗酶液经过Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE琼脂糖弱阴离子交换柱层析,最终得到纯化的内切葡聚糖酶,并对其进行酶学性质分析及串联质谱鉴定。【结果】研究表明:Egn21的分子质量为44.25 kDa,等电点为4.91;酶学特性研究显示:Egn21降解羧甲基纤维素的最适反应温度为40°C,在45°C以下比较稳定。该酶最适pH为6.0,在pH为5.0–8.0条件之间比较稳定。Co~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)对其没有明显作用,而Fe~(2+)、Ca~(2+)、K~(+)、Na~(+)和Mn~(2+)对酶活性有抑制作用,Hg~(2+)会使酶失去活性。【结论】从Q7-31T中分离纯化得到的内切葡聚糖酶Egn21,经过酶学特性与串联质谱鉴定结果显示其属于GH5家族。     

粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s~(-1);Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。     

蛇毒L-氨基酸氧化酶的生物学作用

蛇毒(snake venom,SV)是天然的最丰富的蛋白(酶)源之一,而L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO)是SV的主要蛋白(酶)组成成份,也是SV重要的活性和毒性蛋白成份,其生物学活性多样。近年来的研究表明,SV-LAAOs具有明显的影响血小板聚集、诱导细胞凋亡、细胞毒性、抑菌活性及抗病毒/HIV活性等生物功能。本文简述了SV-LAAO的酶学和结构特性,综述了SV-LAAO以上生物学作用及其相关作用机制,以期为今后深入研究SV-LAAO提供参考。     

前列腺素E2合酶的研究进展

目录 一、前列腺素E2合酶的分类 二、胞质型前列腺素E2合酶 三、膜结合型前列腺素E2合酶-1（mPGES-1） （一）mPGES-1的结构及酶学特性 （二）mPGES-1与COXs偶联 （三）mPGES-1的生理及病理生理作用 四、膜结合型前列腺素E2合酶-2 五、斗族谷胱甘肽S转移酶 六、展望[编者按]