胰岛素蛋白质工程研究进展

近年来,胰岛素蛋白质工程研究进展很快,主要介绍具有临床意义的速效长效和高效胰岛素研究概况,包括分子设计基础,生物活性和应用前景等.此外,还讨论了胰岛素的受体结合部位及胰岛素与其受体相互作用的研究近况．     

一种长效胰岛素的分子设计和目标产品制备

按照“增加次级键,稳化寡聚体”以产生长效性的分子设计原理,以精确的胰岛素三维结构为基础,通过计算机模拟提出对残基B2－Val－Lys／Arg的分子改造方案,并预测它能在不影响生物活力的条件下产生长效效应。在此基础上,用化学半合成的方法制备了目标产品desBl－LysB2胰岛索,并进行了产物活力和基本性质测定。结果表明,与天然胰岛素相比较,该目标产品保有基本的降血糖生物活力(82％),表现出显著的长效效应。     

胰岛素蛋白质工程: [B16Ala]胰岛素和[B26Ala]胰岛素——两个新型的速效人胰岛素

用大动物(猪)降血糖实验证明[B16Ala]胰岛素和[B26Ala]胰岛素是快速降血糖胰岛素. 它们的前体[B16Ala]PIP和[B26Ala]PIP, 在甲醇酵母体系中的分泌表达量分别为650和130 mg/L. 由于它们是新型的分别保留全部和几乎全部胰岛素体内生物活力的速效胰岛素, 且在甲醇酵母表达体系中得到比较高的表达量, 所以具有很好的临床应用前景.     

一种人胰岛素类似物的制备、鉴定与活性研究

采用PCR方法,将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu,在B25和B26位之间插入Glu,构建了［B10 Glu,B25-Glu-B26］胰岛素原融合蛋白基因.利用通用型质粒pBV220构建表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白为包含体形式,约占菌体总蛋白的20%～30%.经过复性、凝胶过滤等步骤得到胰岛素原融合蛋白.用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,经过DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得到胰岛素突变体类似物,并经过质谱测定鉴定.凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质,圆二色谱（CD）测定了构象的变化.并分别测定了放免活性、受体结合活性及小白鼠低血糖惊厥实验.结果表明,突变体分子缔合性明显下降.放免活性和受体结合活性分别约为标准胰岛素的63.5%和114.4%, 整体活力略高于天然胰岛素.     

长效胰岛素的分子设计研究

以工程化制备由分子内在因素制导的可溶性长效胰岛素为目标,提出以“增加次级键,稳化寡聚体”原理,用以减缓注射进入体内的胰岛素六聚体的解聚速率,形成能持续供应胰岛素单体的“库”,从而获得长效作用。据此以精确的胰岛素三维结构为基础,进行了分子设计和计算机模拟,提出了对胰岛素的B链c端和N端修饰产生长效性的分子改造方案,重点分析了B2Lys/Arg和B31Lys/Arg胰岛素。用化学半合成制备的上列二种胰岛素,生物学测试表明确有长效性。2埃分辨率B31-Arg人胰岛素晶体结构的测定显示了Arg-B31与相邻分子Glu-B21间存在一对附加氢键作为长效效应的主要结构基础,证实分子设计思想的基本正确性。     

胰岛素蛋白质工程：[B9Glu]人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第９位的Ｓｅｒ改为Ｇｌｕ。获得速效胰岛素─—［Ｂ９Ｇｌｕ］人胰岛素．它的受体结合能力和体内生物活力分别为猪胰岛素的２１％和４０％。     

A_(21)—Asp人胰岛素突变体2.4埃分辨率晶体结构研究

A_(21)-Asp人胰岛素(A_(21)D-HI)是经由蛋白质工程途径制备的突变体,具有高稳定特性.本文报道在2.4埃分辨率A_(21)-HI X-射线晶体结构的测定,所获结构模型经能量制约的最小二乘技术(EREF)精化,最后的晶体学一致性因子R=0.192,共价键长与标准值的平均偏差为0.019埃.在(2F-F_e)电子密度图上,突变残基A_(21)-Asp清晰可见.与天然胰岛素比较,除践基A_(21)外,突变体分子的构象在该分辨率未见显著变化,具有重要结构意义的残基A_(21)-NH与B_(23)-Co之间的主链氢键在两个独立分子中都仍然保持,A链末端羧基与B_(22)-Arg的侧链胍基间的盐键在分子中也仍然保持.在这一基础上,讨论了突变体与分子的化学稳定性和生物活力的关系.     

短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗对初诊2型糖尿病患者胰岛功能及氧化应激的影响

目的：探讨短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗方案对初诊2型糖尿病患者胰岛功能及氧化应激的影响。方法：选择30例初诊2型糖尿病患者,在一般治疗的基础上,应用短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗方案进行治疗,检测并比较患者治疗前后一般血清指标包括空腹血糖（FBG）、餐后2小时血糖（2h PPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、血清C肽（FCP）,胰岛细胞功能指标包括胰岛素曲线下面积（AUG）、β细胞功能稳态模型评估（HOMA-B）、I30/G30、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛素及C肽水平,以及氧化应激指标包括丙二醛（MDA）及超氧化物岐化酶（SOD）。结果：（1）与治疗前相比,患者治疗后FPG、2h PPG、HbA1c、AUG、HomaB、HomaIR及I30/G30水平均显著改善,差异均有统计学意义（P均〈0.05）;患者口服糖耐量试验0h、1h及2h胰岛素水平及C肽水平均显著回升,差异有统计学差异（P〈0.05）。（2）治疗后,患者MDA水平显著降低,SOD水平显著升高,其差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：短期速效胰岛素联合长效胰岛素强化治疗方案可以明显改善初诊2型糖尿病患者胰岛功能,降低患者体内的氧化应激水平。     

山羊重组促卵泡素长效类似物基因在毕赤酵母中表达

为了获得长效FSH制剂, 利用重叠PCR技术将山羊FSH的a, b亚单位, 通过hCGb亚单位羧基末端延长肽(CTP)基因序列的连接, 构建成单链长效类似物基因FSHb-CTP-a。将其克隆至表达载体pPIC9K, 重组载体线性化处理后电转化至毕赤酵母GS115中, 经判型和G418筛选后获得高拷贝菌株His+Mut+。经甲醇诱导表达后, 进行SDS-PAGE和Western blot分析表明: 重组FSHb-CTP-a的转化子可以正确有效地表达目的蛋白, 分子量约为29 kD。放射免疫分析法(RIA)测定表达上清, 高拷贝转化子的平均表达量为91.849 mIU/mL, 显著高于低拷贝转化子的平均37.419 mIU/mL的表达量, 为FSH的结构研究和长效FSH制剂的生产奠定了基础。     

山羊重组促卵泡素长效类似物基因在毕赤酵母中表达

为了获得长效FSH制剂, 利用重叠PCR技术将山羊FSH的a, b亚单位, 通过hCGb亚单位羧基末端延长肽(CTP)基因序列的连接, 构建成单链长效类似物基因FSHb-CTP-a。将其克隆至表达载体pPIC9K, 重组载体线性化处理后电转化至毕赤酵母GS115中, 经判型和G418筛选后获得高拷贝菌株His+Mut+。经甲醇诱导表达后, 进行SDS-PAGE和Western blot分析表明: 重组FSHb-CTP-a的转化子可以正确有效地表达目的蛋白, 分子量约为29 kD。放射免疫分析法(RIA)测定表达上清, 高拷贝转化子的平均表达量为91.849 mIU/mL, 显著高于低拷贝转化子的平均37.419 mIU/mL的表达量, 为FSH的结构研究和长效FSH制剂的生产奠定了基础。     

双链杂交分子“胰岛素—类胰岛素生长因子—I”

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２－２９及２２－３２为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素茵子－Ｉ”,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ和Ｉｎｓ－ＩＧＦ－Ｉ。研究了它们的胰岛中生物活性。结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５－Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２９氨基酸顺序颠紧及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽都不影响胰岛素的生物活力。     

促胰岛素释放肽和GLP-1类似物研究进展

近年来,从细菌、真菌等低等生物和爬行类、哺乳类等高等动物的体内,都发现存在着结构和功能相关、相似的促胰岛素释放肽或GLP-1类似物.目前国内外研究都在密切关注胰高血糖素样肽-1(glucagonl-ikepeptide-1,G LP-1)和G LP-1类似物等胰高血糖素家族肽,对其进行基因工程高效表达或通过组合化学方法修饰、改造,从而设计治疗Ⅱ型糖尿病的多肽类药物.但是,从天然生物体内,尤其是最近从两栖类动物皮肤分泌液中和响尾蛇毒素中发现了大量能稳定促进胰岛素释放的生物活性肽,却还没有受到足够的重视,它们将很可能为筛选和开发出安全、高效、半衰期长的治疗Ⅱ型糖尿病新药物提供全新的思路和广阔的前景.     

双链杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－I

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素（ＤＯＩ）和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２～２９（８肽）及２２－３２（１１肽）为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－Ｉ,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（８）和Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（１１）。研究了它们的胰岛素生物活性,结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５～Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２ｋ９氨基酸顺序颠倒以及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽（Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ）都不影响胰岛素的生物活力。     

胰岛素蛋白质工程：高活性（B10Asp）人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第１０位的Ｈｉｓ变为Ａｓｐ,获得高活力胰岛素（Ｂ１０Ａｓｐ）人胰岛素,其受体结合能力和离体生物少分别为猪胰岛素的２６２％和２３５％体内生物活力也明显高于猪胰岛素,它的促细胞生长能力为猪胰岛素的１７４％。     

胰岛素蛋白质工程：高活性［B10Asp］人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第１０位的Ｈｉｓ变为Ａｓｐ,获得高活力胰岛素──［Ｂ１０Ａｓｐ］人胰岛素。其受体结合能力和离体生物活力分别为猪胰岛素的２６２％和２３５％;体内生物活力也明显高于猪胰岛素;它的促细胞生长能力为猪胰岛素的１７４％。     

人降钙素类似物的合成及活性研究

通过对鲑鱼降钙素和人降钙素结构的比较,设计并合成了人降钙素类似物ｍｈＣＴ－２。利用空气氧化获得分子内二硫键,经分离纯化,产物达ＨＰＬＣ及毛细管电泳均一,蛋白质序列分析和质谱分析符合理论值。在大鼠降血钙生物活性测定中,利用量反应平行线法进行ｍｈＣＴ－２的生物效价判定达２０００ＩＵ／ｍｇ,比ｈＣＴ的效价高一个数量级。     

高活力胰岛素研究：B3—Lys猪胰岛素的结晶及初步晶体学分析

用化学半合成方法制备的Ｂ３—Ｌｙｓ猪胰岛素（Ｂ３ＫＰＩ）具有与天然猪胰岛素相同的体内生物活力,但其体外生物活力及受体结合活力比天然猪胰岛素高。本文报道Ｂ３ＫＰＩ的晶体生长,初步晶体学分析及衍射数据与处理。Ｂ３ＫＰＩ晶体的衍射分辨率可以达到２．１Ａ（１Ａ＝０．１ｎｍ）,空间群为Ｒ３,晶胞参数为：ａＨ＝ｂＨ＝８２．２３ＡＣＨ＝３４．１７Ａ．收集了一套２．１Ａ分辨率的衍射数据,数据完全度为８１％,Ｒｍｅｒｇｅ为２．９％。     

用木素木霉与凤尾菇菌两菌交替发酵法提高纤维素酶活力研究*

用木素木霉和凤尾菇菌研究了它们的交替发酵的酶活力,发现它们交替发酵的酶活力明显比单一菌种培养时为高,两者的差异高的竟达15倍以上,这为提高纤维素酶的产量和酶活性开辟了一条新的酶发酵工艺途径。     

用木素木霉与凤尾菇菌两菌交替发酵法提高纤维素酶活力研究

用木素木霉和凤尾菇菌研究了它们的交替发酵的酶活力,发现它们交替发酵的酶活力明显比单一菌种培养时为高,两者的差异高的竟达15倍以上,这为提高纤维素酶的产量和酶活性开辟了一条新的酶发酵工艺途径。     

长效胰岛素与微载体结合对2型糖尿病大鼠血糖浓度的控制的探讨

为探讨微载体结合长效胰岛素对Ⅱ型糖尿病大鼠血糖标准浓度的控制持续时间,根据变性胶原微载体结合长效胰岛素的适当比例,腹腔注射,观测注射前和注射后大鼠血糖指标,进而判断微载体与长效胰岛素结合对糖尿病大鼠血糖控制的持续时间作用效果。研究表明微载体与长效胰岛素结合对Ⅱ型糖尿病大鼠模型能够起到延缓长效胰岛素释放的功效,并且效果显著。