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1.
用原生质体瞬间表达的方法证明,在烟草细胞中TMV外壳蛋白亚基因组RNA的生成,不是通过核酸酶在基因组RNA上直接切割,也不是通过在生成负链RNA时预成性终止,再从这种负链RNA终止部位起始产生的,TMV外壳蛋白亚基因组RNA,是TMV识别利用负链RNA中间的亚基因组启动子后产生的,这个启动子位于外壳蛋白读码框5′端256碱基范围之内,但大于48个碱基,虽然TMV能利用单链的负链RNA上的亚基因组启 相似文献
2.
HCV NS5B基因片段克隆入BAC-TO-BAC^TM重组杆状病毒表达系统的pFASTHTc载体质粒,转化DH10BAC^TM感受态细菌获得重组的Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf细胞,获得的重组杆状病毒可表达目的蛋白。免疫印迹和体外活性检测表明,所表达蛋白为HCV NS5B蛋白,具有多聚酶活性。 相似文献
3.
我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸tRNA基因(SelC基因)连接到分泌型表达质粒PVT102U-αMFL中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于SelC基因的下游.将该质粒转化酵母,通过SDS-PAGE分析,在SD液体培养基中检测出7~8kd的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总RNA用互补与该tRNATC茎环区的21-mer寡核苷酸,经5′标记后作为探讨进行Northernblot。结果有两条较强的条带和一条较弱的条带,较强条带中一条相当于790nts左右,另一条相当于370nts左古,根据组建的表达型质粒结构资料推测790nts左右的条带是由RNA聚合酶II转录的未被加工的前体;370nts左右的条带是5′端被加工而3′端未被加工的分子,较弱的条带则是相当于90nts左右的成熟tRNA分子。因此,我们认为RNA聚合酶II可以转录tRNA基因。由于实验用酵母的3′内切核酸酶含量较低,致使带长尾巴的tRNA前体3′端加工速度缓慢。 相似文献
4.
金海翎 《Acta biochimica et biophysica Sinica》1996,28(4):358-366
根据对TMV高效复制和基因表达的顺式作用元件的分析,在体外重组包装了2个缺失型TMV粒子:TMVRP和TMVCP。前者缺失了TMV外壳蛋白CP基因的3′端及后序区域,后者缺失了大部分复制酶基因。把两者分别或共同电击感染烟草原生质体:1.用CP抗体进行免疫印渍检测,单独感染的原生质体内的CP在16小时内无增加,而在共同感染的原生质体内,CP在感染2小时后就开始明显增加。2.用RT一两次PCR法专一地检测新生负链RNA的合成情况,在单独感染的原生质体内没有检测到,但在混合感染的原生质体内在感染1小时后就检测到CP基因特异的负链RNA的形成,并用Southern杂交得到进一步验证。这些结果表明,复制酶缺失型TMVCP内的CP基因不能表达,但可以在TMVRP存在时,通过其所表达的复制酶互补作用得到复制从而有效表达. 相似文献
5.
为了验证转基因烟草中表达的外壳蛋白(CP)能够重新包被侵入的烟草花叶病毒(TMV)的假设,利用抗原表位标记的方法观察CP亚单位在病毒5′端的交换。通过PCR 方法将来源于鼠肝炎病毒(MHV) S蛋白的两个小肽段(11 a.a.和15 a.a.)的DNA序列分别插入TMV-U1 CP基因邻近3′端的两个位点,并构建了带有外源序列的TMV 侵染克隆V9 (11 a.a.)和E15 (15 a.a.)。通过体外转录反应,得到V9 RNA 及E15 RNA。突变病毒RNA 侵染烟草(Nicotiana tabacum )后表现不同特性。V9 和E15 侵染XanthiNN烟草后同野生型TMV一样产生枯斑。但是,当它们侵染Xanthinn 烟草时,V9 产生同侵染XanthiNN 烟草相同的枯斑,而E15的特性同TMV-U1几乎完全相同,能对Xanthinn 烟草进行系统侵染并在叶片中聚集大量的带有外源片段的外壳蛋白,而且病毒的结构极其稳定。V9 和E15 特性的差异可能是由于外源片段在外壳蛋白中存在位置的不同影响了外壳蛋白的结构所致 相似文献
6.
将细胞表面粘附分子CD44S的cDNA反向插入到真核细胞表达载体pMAMneo-CAT和MMTV-LTR启动子下游,构成CD44S的反义RNA载体.将其用电击法导入CD44+的人黑色素瘤细胞系HMM239,转录出的反义RNA能不同程度地抑制HMM239表面CD44的表达.CD44的表达被抑制后,瘤细胞与透明质酸的结合力下降,细胞的体外生长速率不受影响.将其接种裸鼠皮下,发现其致瘤性明显降低 相似文献
7.
优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文) 总被引:1,自引:0,他引:1
mRNA的翻译起始区(TIR)的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因为模型,将PCNA基因5′端编码区的114bp的顺序插入质粒pTZ19R中LacZ′的5′端构成融合基因。用定点突变法在PCNA的AUG的8位插入一个Shine/Dalgarno(SD)顺序GAGGT,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用PCR法在SD顺序两侧,即SD上游6个碱基和SD与AUG之间7个碱基,进行随机突变,它们与结构基因5′端序列形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株JM109(DE3),5′PCNA-lacZ′mRNA可通过诱导表达T7RNA聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在X-gal板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到269个5′PCNA-lacZ′融合质粒。从中选择8个不同蓝色的重组子进行β-gal活性测定,结果表明它们的酶活性相差在20倍以上。而RNA点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。 相似文献
8.
反义RNA抑制人黑色素瘤细胞表面粘附分子CD44的表达及抑瘤效应 总被引:2,自引:0,他引:2
将细胞表面粘附分子CD44S的CDNA反向插入到真核细胞表达载体PMAMneo-CAT和MMTV-LTR启动下游,构成CD44S的反应RNA载体,将其用电击法导入CD44的人黑色素瘤细胞系HMM239,转录出的反义RNA能不同程度地换制HMM239表面CD44的表达,CD44的表达被抑制后,瘤细胞与透明质酸的结合力下降,细胞的体外生长速率不受影响,将其接种裸鼠皮下,发现其致瘤性明显降低。 相似文献
9.
粘虫核型多角体病毒一个新基因的序列和结构研究 总被引:2,自引:0,他引:2
本文报道TsNPVDNAEcoRV/XhoI的5.5kb片段的克隆及其物理图谱。测定了其中一个819bP片段的全序列。在长346bp的完整ORF的5’端除有TATAbox和CAATbox以外,还发现有典型的早期基因启动子元件ACGT和GC单元以及晚期基因的转录起始保守序列TTAAG。预测的ORF产物为114个氨基酸、分子量为13kD的蛋白质,故命名为p13蛋白。在p13基因的C端和N端分别有一个亮氨酸拉链和两个类亮氨酸拉链结构(我们称为亮氨酸转型结构和LVT重复结构〕.从终止密码起有一个双发卡环结构,p13基因的5’端调控单元及其排列与BmNPV和AcNPV的细胞序死抑制基因(p35)十分相似,但p13基因与已经发现的杆状病毒基因序列和氨基酸序列没有同源性.因此,这是一个新的早晚期基因,其调控元件可能具有重要功能。 相似文献
10.
反义寡聚脱氧核苷酸(ODN)衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
为比较针对中不同基因的ODN硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒(HBV)的抗原表达,合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列,多聚酶蛋白编码基因起码上游及内部序列3.5kbRNA3'端起始负链DNA合成序列互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物,分别在HBV短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制HBV抗原表达的作用。结果发现,当培养液中ODN浓度为20μmol/LJF ,四种ODN均能抑HepG2.2.15细胞 相似文献
11.
一个双价锤头型核酶在体外对两种不同植物病毒RNA的专一切割作用 总被引:1,自引:0,他引:1
根据锤头核酶模型,设计合成了一个以黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)亚基因组RNA为底物的锤头型核酶(RZC),在证明它能有效切割该底物后,再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒(TMV)移动蛋白(MP)亚基因组RNA的锤头型核酶(RZ1)相互串联构成了一个双价核酶(RZ1C),体外结果表明,这个双价核酶能与相应的单价核酶RZ1和RZC一样专一而有效地切割CMV CP和TMV MP RNA 相似文献
12.
中国大麦黄花叶病毒分离物的分子变异 总被引:4,自引:0,他引:4
13个供试的中国和英国大麦黄花叶病毒(BaYMV)分离物,经RNA1和RNA2全基因组不同区域DNA片段背地里单构象多态分析(SSCP),外壳蛋白基因和RNA2 70kD基因5端705碱基序列分析,以及此7-5碱基DNA片段限制性内切酶图谱分析结果,它们的RNA1和RNA2彼此无一相同,其中RNA2变异比RNA1更大。由于变异十分复杂,且没有规律性,因而当前通用的分子生物学技术尚不能简单地BaYM 相似文献
13.
在酵母体内用RNA聚合酶II表达大肠杆菌tRNA^Sec基因 总被引:1,自引:1,他引:0
我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸tRNA基因(SelC基因)连接到分泌型表达质粒PVT102U-αMFL中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于SelC基因的下游。将该质粒转化酵母,通过SDS-PAGE分析,在SD液体培养基中检测出7 ̄8kd的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总RNA用互补与该tRNA TψC茎环区的21-mer寡核苷酸,经5'标记后作为探针进行North 相似文献
14.
根据锤头核酶模型,设计合成了一个以黄瓜花叶病毒(CMV) 外壳蛋白(CP) 亚基因组RNA 为底物的锤头型核酶(RZC) 。在证明它能有效切割该底物后,再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒(TMV) 移动蛋白( MP) 亚基因组RNA 的锤头型核酶(RZ1) 相互串联构成了一个双价核酶(RZ1C) 。体外结果表明,这个双价核酶能与相应的单价核酶RZ1 和RZC 一样专一而有效地切割CMVCP和TMV MPRNA。 相似文献
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将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质闰可表达RNA聚合酶。将PV的5’NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5’NCR质粒; 相似文献
16.
DETECTIONOFINFECTIOUSVIRUSANDVIRALRNAINTHEMYOCARDIUMOFMICEINFECTEDEXPERIMENTALLYWITHCOXSACKIEVIRUS’B3XiaomeiOuyang,HongyiZhan... 相似文献
17.
以AcNPV凋亡抑制基因p35为探针,与LsNPVDNA的限制性片段和LsNPVDNAEcoRV片段杂交,发现EcoRV5.5kb片段有强烈的杂交信号。将此片段亚克隆后,测定了1244bp序列,发现一个完整的ORF,推导的302个氨基酸与AcNPVp35蛋白有70.4%的氨基酸同源性,证明所测ORF为LsNPV的p35基因。结构分析发现其5′端有早期基因启动子元件GC、ACGT和TATAbox。有22bp的顺向重复序列,包括由两个重叠的TATAbox和上下游两个ACGTmotif组成的两套启动子元件,这些结构特征与AcNPV的凋亡抑制基因十分相似。 相似文献
18.
分别利用5’RACE和3’RACE确定了CMV-SDRNA2的5’和3’未端序列,在此基础上,利用RT-PCR得到了RNA2的5’端一半的cDNADQ BTG Pc25和3’端一半的cDNA克隆PC23,并通过拼接构建了RNA2全长cDNA克隆PC2F。 相似文献
19.
分别利用5’RACE和3’RACE确定了CMVSDRNA2的5’和3’末端序列,在此基础上,利用RTPCR得到了RNA2的5’端一半的cDNA克隆pC25和3’端一半的cDNA克隆pC23,并通过拼接构建了RNA2全长cDNA克隆pC2F。通过对pC25和pC23进行序列测定,得到了RNA2的全序列。序列分析结果表明CMVSDRNA2由3048nt组成,其中存在2个部分重叠的阅读框ORF1(79~2652nt)和ORF2(2414~2746nt),分别编码858aa的2a蛋白和111aa的2b蛋白,并在2a蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系RNA2核苷酸序列与分属CMVI亚组的Fny株系和II亚组的Q株系RNA2的核苷酸序列同源性分别为917%和756%;2a蛋白的氨基酸序列同源性分别为938%和677%,2b蛋白的氨基酸序列同源性分别为830%和513%。同源性比较的结果表明SD株系属于CMVI亚组。 相似文献
20.
T7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能 总被引:1,自引:0,他引:1
根据a-鹅膏蕈碱(a-amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转 移酶基因(CAT)作为报道基因进行体内表达实验,证明T7噬菌体启动子可为真核生物RNA 聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性DNA-蛋白质凝胶泳动技术,分别以TATA框、CAAT 框、GC框和八核苷酸序列(octamer)为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的T7启动子可能 与 TFⅡD起始转录因子结合,形成 DNA-核蛋白质结合物。将 TATA框和八核苷酸序列分别 接入T7启动子上游,CAT实验显示八核苷酸序列可以增强RNA聚合酶Ⅱ对T7启动子的转录 起始作用。实验结果表明T7启动子可作为RNA聚合酶Ⅱ的顺式作用因子。 相似文献