蛋白质错误折叠循环扩增及其在朊病毒蛋白检测中的应用研究进展

朊病毒蛋白（prion protein,PrP）是传染性海绵状脑病的病原体,其检测是该病诊断的重要依据。该文从原理、方法、影响因素和检测应用方面对蛋白质错误折叠循环扩增（protein mis-folding cyclic amplification,PMCA）这种朊病毒蛋白新型检测技术做了介绍,旨在为朊病毒蛋白的检测和发病机制研究提供理论参考。     

免疫印迹法检测牛海绵状脑病和羊瘙痒病

用大肠杆菌表达的牛朊病毒正常成熟蛋白 (BoPrPC)免疫新西兰白兔 ,获得了与朊病毒蛋白 (PrP)反应的抗体T1。根据致病型朊病毒 (PrP^SC)能抵抗蛋白酶消化的特性 ,用蛋白酶K消化脑组织提取物 ,以抗体T1进行免疫印迹反应 ,结果表明从接种羊瘙痒病朊病毒 2 6 3K的金黄地鼠脑组织提取物内检测到抗蛋白酶K消化的致病型PrPSC ,而正常金黄地鼠脑组织中没有抗蛋白酶消化的蛋白。以我国正常牛羊为材料 ,制备其脑组织提取物 ,用上述方法和抗体T1进行检测 ,结果没有发现抗蛋白酶K的任何蛋白存在 ,说明没有牛海绵状脑病和羊瘙痒病存在。用 1A8抗体也获得了同样的结果。这些结果表明可以用自制的抗血清检疫牛海绵状脑病和羊瘙痒病 ,防止其传入我国     

一种新的PrP无细胞构象转化系统的建立

PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素。为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kD HaPrP蛋白,Western blot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应。将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHs),与纯化的scrapie 263K毒株仓鼠感染脑组织PrP^Se蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Western blot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD。这表明HaPrP^sen可以被转化为HaPrP^res。实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代^35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究。     

PrP的胞内运输与朊病毒病

朊病毒病,即传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）,是一类致死性的神经退行性疾病,存在散发性、感染性和遗传性3种形式。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrPc（cellular PrP）转化为异常构象的PrP^Sc（scrapie PrP）是至关重要的,但是朊病毒的增殖如何导致神经元凋亡仍不清楚。PrPc的胞内运输在朊病毒病中发挥重要作用,朊病毒感染后PrP^C转化为PrP^Sc,及遗传性朊病毒病中PrP突变可能影响PrP的生物合成、亚细胞定位及转运过程,通过干扰PrP^C的正常功能或产生毒性中间体而导致神经系统病变。现对近年来关于PrP胞内运输在朊病毒病中的作用进行综述。     

微管相关蛋白tau与朊蛋白的相互作用

微管相关蛋白tau参与了许多神经退行性疾病的发生, 其中包括一些人类可传播性海绵状脑病. 为了探讨tau与朊蛋白(PrP)之间可能存在的关系, 首先通过GST pull-down和免疫共沉淀等技术发现重组tau蛋白可通过微管结合区与来源于正常叙利亚仓鼠脑组织中的正常细胞膜朊蛋白(PrP^C)和羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织的异常朊蛋白(PrPSc)相结合. 利用免疫共沉淀实验发现在正常和羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中存在tau蛋白与PrPC和PrPSc的相互作用, 并且利用激光共聚焦方法检测到PrP和tau蛋白在CHO细胞内具有共定位的关系. 为了确定PrP与tau蛋白相互作用的部位, 构建了不同区域的PrP片段, 从而证明PrP与tau蛋白相互作用的区域位于PrP的N端序列(23~91 aa). PrP与tau蛋白分子间相互作用的直接实验证据提示tau蛋白可能参与PrP的正常生理功能以及朊病毒病的病理过程.     

朊病毒研究的现状

朊病毒疾病是人和动物中的一种传染性,散发性和遗传性的神经退行性脑病,到目前为止,关于此病的致病机制并不十分清楚,但有研究表明该病是由一种正常蛋白PrP的不正常折叠形式在大脑中积聚所致,许多哺乳动物和鸟类的朊病毒基因和氨基酸序列都已被分析,而且传染源的部分性质已经被阐明,朊病毒疾病的传染和潜伏期在人和动物中有很大差异,一些变异与疾病的自发性,易感性和抵抗性有关,为得到关于现毒更多的信息,已对其基因两端进行了大范围的DNA测序分析,至于正常细胞蛋白PrP的生理功能,现在也并不确定。     

与朊毒体相关的鱼类朊蛋白研究概况

疯牛病(mad cow disease),即牛传染性海绵状脑病(bovine transmissible spongiform encephalopathy,BSE)的俗称,是一种慢性消耗性、致死性、中枢神经系统退行性疾病。疯牛病被认为与朊毒体(Prion)有关,朊毒体是由正常朊蛋白(Prion protein,或者PrPC)发生构象改变后形成的异常蛋白(PrPSc)。疯牛病的发生引起了世界各国政府和科学界的高度重视,PrP的起源及其功能研究已成为研究热点。鱼类PrP相关蛋白的研究正在展开中,由于鱼类PrP相关蛋白与朊蛋白的结构相似,鱼类感染TSE类似病存在理论上的风险。本文全面地综述了疯牛病的概况、朊毒体的特性、朊毒体与哺乳动物朊蛋白、鱼类PrP相关蛋白(PrP1、PrP2和PrP3)及鱼类其他PrP相关蛋白的研究情况,为国内水生动物PrP相关蛋白研究提供参考。     

抗牛PrP多肽单克隆抗体的制备及其在牛PrP 检测中的应用

为获得广谱抗哺乳类动物PrP单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb), 用牛朊蛋白(prion protein, PrP)多肽(209~228 aa)与匙孔槭血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联物免疫Balb/C小鼠. 经细胞融合和克隆后获得针对上述多肽的杂交瘤细胞株. 分别用Western blot和免疫组化(immunohistochemistry, IHC)的方法检测这些McAbs与重组人(human, Hu)、牛(bovine, Bo)、仓鼠(hamster, Ha)PrP蛋白、牛脑组织中的正常朊蛋白(cellular PrP, PrPc)和致病性朊蛋白(scrapie of prion, PrPSc)的反应性. 本文为制备高效价抗PrP McAb提供了一个简单、易行的方法. 制备的抗体可用于研究哺乳类PrP生物学特性, 检测可传播性海绵样脑病, 特别是对牛海绵样脑病的诊断具有重要意义.     

硫醇基团的氧化还原过程对人正常朊蛋白聚集和纤维化特征的影响

本研究旨在通过体外对纯化的原核重组人正常朊蛋白硫醇基团的氧化还原过程,探究二硫键的改变对其生化特性的影响。蛋白沉淀实验显示重组正常人朊病毒蛋白经过硫醇基团的氧化还原过程明显增加了其聚集性;硫磺素T(Thioflavin T ,ThT)实验测定发现,经过硫醇基团的氧化还原过程重组PrP蛋白的纤维形成增多;圆二色谱（Circular Dichroism, CD）测定显示,处理后的重组PrP蛋白二级结构发生改变,其β-折叠结构比例显著增多;蛋白酶K消化实验也进一步显示硫醇基团的氧化还原后PrP的蛋白酶K抵抗能力有所增加。这些结果提示二硫键的形成可明显地改变PrP的二级结构,促进朊蛋白聚集和成纤维过程。     

朊病毒感染对细胞中三羧酸循环关键催化酶的影响研究

为了研究朊病毒感染对细胞氧化供能的主要途径—三羧酸循环关键催化酶的影响。使用ATP检测试剂盒检测朊病毒感染后细胞的ATP表达情况,采用蛋白免疫印迹方法检测朊病毒感染细胞中三羧酸循环关键催化酶的表达情况;使用细胞免疫荧光对催化酶进行细胞定位;应用线粒体分离试剂盒分离线粒体,检测线粒体中催化酶的表达情况。结果显示朊病毒感染后的细胞ATP表达水平明显降低,进一步检测三羧酸循环过程中三个主要的催化酶,发现这三个催化酶在朊病毒感染的细胞中表达量明显降低,免疫荧光实验显示催化酶与线粒体标志蛋白具有空间共定位现象,并发现在朊病毒感染细胞的线粒体中这三个催化酶的表达也显著降低。本研究发现朊病毒感染细胞中三羧酸循环催化酶的表达量明显降低,导致ATP产能下降,影响细胞代谢水平。     

载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究

利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究.结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白.ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白（PrP23-231）在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端.这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路.     

蛋白激酶CK2与PrP蛋白的体外相互作用研究

为了探讨蛋白激酶CK2与PrP是否存在分子间相互作用,利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中分别扩增出蛋白激酶CK2a和CK2β基因,并在E coli中表达了融合蛋白HIS-CK2α和GST-HISCK2β.利用pU-doWn及免疫共沉淀实验检测PrP与CK2的分子间相互作用.结果显示,重组PrP可与CK2α出现特异性结合,但不与CK2β发生反应.天然状态下脑组织中的CK2与PrPc也发生相互作用.PrP与CK2α亚基相互作用的区域位于PrP的C-端90～231位氨基酸.本研究从分子水平上提供了人重组和天然CK2和PrP蛋白相互作用的实验依据,为深入探讨CK2与朊蛋白作用的生物学意义和在朊病毒病发病过程中的作用提供了科学线索.     

传染性海绵状脑病的诊断进展和存在的问题

传染性海绵状脑病是由朊病毒引起的人和多种哺乳动物以神经退行性变化为主要特征的一种慢性致死性传染病。引起这类疾病的病原因子是一种编码宿主蛋白的PrPC转变为异常的PrPSC沉积在大脑,导致传染性海绵状脑病的发生。本文从临床症状识别、组织病理学诊断、致病性朊蛋白检测、生物学测定以及毒株鉴定等几个方面作一回顾和总结,为揭示朊病毒疾病致病机理和诊断研究提供借鉴。     

朊病毒疾病的诊断技术

朊病毒疾病即海绵状脑病,是人的动物中的一类致死性中央神经系统疾病,介绍了朊病毒疾病的诊断技术,病理诊断,基因诊断,免疫诊断和血液检测。     

中国小尾寒羊朊病毒蛋白基因的基因型属于PrP^ARH

从中国小尾寒羊血液分离的白细胞中提取基因组DNA,用PCR反应扩增出羊的正常朊病毒蛋白（OvPrP^c）基因,将其克隆到质粒pUC19中。序列分析结果表明该克隆里含有771bp的OvPrP^c基因,其中有7个碱基与已报道的OvPrP^c基因不同,并导致了3个氨基酸的改变,基因型属于PrP^ARH,这3个密码子的多态性可能与羊对羊瘙痒病的敏感性或抵抗力有关。将编码成熟蛋白质的朊病毒蛋白基因插入质粒pET30a,在大肠杆菌表达了约23kD的PrP25-231蛋白,并用洗涤包涵体、离子交换层析、反相层析纯化PrP25-231蛋白,经SDS-PAGE及免疫印迹分析表明,得到纯化的蛋白质是PrP25-231。     

朊病毒的分子遗传学研究

院病毒（prion）是一种能引起哺乳动物中枢神经系统退行性疾病,即一般称为传染性海绵状脑病（BE）的病原因子。这些疾病包括人类克雅氏病忙reutrfeltJocob）、致死性家族失眠症、羊瘙痒症和疯牛病等[1]．1982年美国科学家Prusiner从感染了瘙痒症的叙利亚老鼠脑中分离出具有传染性的蛋白因子,并首先提出朊病毒这一名词,以与病毒、类病毒相区别。朊病毒最显著的特征是不含核酸。现已知道朊病毒（prionprotein,PrP是由宿主染色体基因PrP编码的一种正常细胞蛋白,在非患病个体中以低水平存在。这种蛋白在细胞内质网上合成、高尔基小体中…     

羊瘙痒因子263K毒株感染金黄地鼠后鼠脑组织中检出PrP-res蛋白及其神经病理学研究

羊瘙痒病是累及山羊及绵羊的可传播海绵状脑病。为了观察羊瘙痒因子 (Scrapie)的病原特征及病理组织改变特点 ,将羊瘙痒因子 2 6 3K毒株颅内接种至金黄地鼠。经过 81～ 110天的潜伏期 ,89%的动物发病 (17/19只 )。对发病地鼠的神经病理学检测发现 ,海绵状空泡变性的检出率为 5 9% ,淀粉样斑的检出率为 17 6 %。利用免疫组化和蛋白酶消化后的Westernblotting检测证实 ,10 0 %的发病地鼠的脑组织中都出现蛋白酶抗性朊蛋白 (PrP res)。17只发病地鼠脑组织提取物中 ,PrP res的泳动位置和分子量大小完全一致 ,出现两条分子量在 2 5kD～ 31kD的反应带。尝试应用快速玻片印迹法检测病变组织中的PrP res,结果显示 ,与常规固定包埋切片的免疫组化检出效果相似。这提示脑组织印片法可成为临床检测克 雅氏病 (Creutzfeldt Jacobdisease ,CJD)患者脑组织活检标本中PrP res的快速、有效的方法。羊瘙痒因子 2 6 3K成功感染金黄地鼠再次证明 ,金黄地鼠是TSE感染因子良好的动物模型 ,发病率高 ,潜伏期短 ,发病动物PrP res的检出率明显高于典型病理改变的检出率。新生成的PrP res的电泳类型与接种的TSE因子有关 ,与宿主的个体差异无关 ,提示TSE感染因子的确存在“株”的现象。     

多种缺损及突变的PrP蛋白在杆状病毒中的表达和纯化

PrP蛋白多肽序列上存在有不同的功区域,影响着蛋白质构象、理化特性和生物学功能。为了获得不同缺损及突变的仓鼠PrP蛋白,以PCR方法获得不同大小的PrP基因片段,利用PCR大引物点诱变法获得带有突变糖基化位点PrP序列。所有PCR产物测序鉴定正确后,分别与pFASTBAC Hb质粒连接,与穿梭载体DH10BAC转座,构建各种重组病毒。Western blot证实,8种不同长度的仓鼠PrP蛋白可在昆虫细胞Sf9中表达,包括全序列的PrP1-231,信号肽缺失的PrP23-231;N端缺损的PrP90-231和PrP120-231;C端缺损的PrP1-199、PrP1-174和PrP1-160。糖基化位点突变：PrP23-231(N181Q).其中不带信号肽序列的PrP蛋白均呈HIS融合蛋白,而N端带有信号肽的PrP蛋白则不能与Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱结合,但可以用PrP特异性抗体发生免疫沉淀反应。这提示PrP信号肽序列在昆虫细胞中可能也发挥着与哺乳动物细胞相似的作用。不同缺损及突变的PrP蛋白的表达和纯化为进行蛋白生物学性状研究奠定了基础。     

多肽PrP106—126对培养神经细胞朊蛋白基因表达的影响

神经细胞是传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）的重要靶细胞,PrP106-126是研究TSEs致病机理的理想工具,对PrP106-126作用的培养神经细胞模型进行研究,有利于了解朊蛋白的功能和探讨TSEs的分子致病机制。本研究利用PrP106-126构建了大脑皮质和小脑颗粒神经元作用模型,对神经细胞的存活和朊蛋白基因的表达进行了研究。结果表明：PrP106-126作用于培养神经细胞导致其存活率的显著下降;大脑皮质神经元经PrP106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达的量明显下降,处理后的小脑颗粒神经元也有类似的情况出现,两者之间下降的幅度和时间不同。我们的研究结果为研究朊蛋白在TSEs发生中的作用和深入了解TSE的分子致病机制提供了基础数据。     

多肽PrP106-126对培养神经细胞朊蛋白基因表达的影响

神经细胞是传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)的重要靶细胞,PrP106-126是研究TSEs致病机理的理想工具,对PrP106-126作用的培养神经细胞模型进行研究,有利于了解朊蛋白的功能和探讨TSEs的分子致病机制.本研究利用PrP106-126构建了大脑皮质和小脑颗粒神经元作用模型,对神经细胞的存活和朊蛋白基因的表达进行了研究.结果表明PrP106-126作用于培养神经细胞导致其存活率的显著下降;大脑皮质神经元经PrP 106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达的量明显下降,处理后的小脑颗粒神经元也有类似的情况出现,两者之间下降的幅度和时间不同.我们的研究结果为研究朊蛋白在TSEs发生中的作用和深入了解TSE的分子致病机制提供了基础数据.