HBV相关肝纤维化小鼠模型的建立及关键表型深度分析研究

目的 探索HBV感染所致肝纤维化小鼠模型形成条件及表型分析。方法 以18只CBA/CaJ小鼠为研究对象,随机分为对照组(n=4)和实验组(n=14),实验组按照每只2μg的剂量、通过高压水动力方法进行尾静脉注射cccDNA,对照组注射等体积PBS,转染68周后采样。通过qPCR方法检测肝中HBV DNA及HBV cccDNA,ELISA方法检测血清HBsAg、HBeAg,免疫组化检测肝组织中HBsAg、HBcAg,用一代测序法检测HBeAg⁺/HBsAg^-及HBeAg^-/HBsAg⁺组织DNA基因测序,生化分析ALT和AST,HE染色、天狼星染色及Masson染色分析肝组织病理。结果 实验组中,100%的小鼠HBV-DNA拷贝数高于1000 copies/mL;小鼠肝组织cccDNA拷贝数显著高于空白组(P<0.05);42.9%的小鼠血清HBsAg和HBeAg呈阳性;60%的小鼠肝HBsAg呈阳性和26.7%的小鼠肝HBcAg呈阳性;HBeAg^-/HBsAg^+...     

高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转导法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型

用高嗜肝性的重组8型腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus type8,rAAV8)载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因组(ayw亚型)体内转导法,建立持续表达HBV抗原的C57BL/6小鼠模型。首先,制备并纯化了携带1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型)的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3HBV);将rAAV8-1.3HBV以剂量2×10e11vg/只注射C57BL/6小鼠(Viralgenome,vg);在不同时间点实施尾静脉采血,采用ELISA方法监测血清中HBsAg和HBeAg的水平及动力学变化;10周后处死小鼠,取血液、肝组织样本,提取基因组DNA,荧光定量PCR检测HBVDNA拷贝数;利用鉴定HBVDNA环化形式的特异性引物进行PCR扩增以检测肝组织中环化的HBVDNA,并检测HBV抗原特异性的免疫组化和肝脏病理变化。结果显示,注射rAAV8-1.3HBV的3只C57BL/6小鼠第1周开始在血液中检测到HBsAg和HBeAg的表达,并持续至第10周均为阳性,其中HBsAg的表达水平经历了一个上升-下降-再上升的过程(注射后第4周时最低,第6周后维持较高水平),而HBeAg表达水平则持续阳性且比较稳定。荧光定量PCR结果显示,3只小鼠10周后血清中HBV DNA的拷贝数分别为4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL,肝脏中则分别为8.0×106、5.7×106、2.6×106copies/g肝组织。在3只小鼠肝组织中均检测到环化HBV DNA,提示AAV8载体携带的线性HBV DNA成功回复成环化HB VDNA。免疫组化分析显示3只小鼠肝脏中均存在HBsAg和HBcAg表达;体内转染10周后肝脏组织切片的HE染色分析显示未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常。结果表明,本研究利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒基因组(ayw亚型)体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了HBV病毒在肝内稳定复制并持续表达HBV抗原的小鼠模型,为进一步研究HBV慢性持续感染的机制与应用于药物以及疫苗评价打下了基础。     

用rAAV8-1.3HBV制备两种品系小鼠乙型肝炎病毒感染模型的比较研究

我们先前用rAAV8-1.3HBV静脉注射C57BL/6小鼠成功地制备了慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染模型。为了探讨不同品系的小鼠对rAAV8-1.3HBV静脉注射是否具有不同反应,本研究比较了C57BL/6和BALB/c小鼠静脉注射重组病毒后外周血中HBV抗原和抗体水平、病毒载量和肝脏组织HBcAg表达情况,以及不同剂量重组病毒注射与这些指标的关系。将低(4×109 Viral genome,vg)、中(4×1010vg)和高(4×1011vg)三种剂量的rAAV8-1.3HBV通过尾静脉注射至C57BL/6和BALB/c小鼠,分别利用ELISA和荧光定量PCR方法检测血清中的HBV抗原、抗体水平以及HBV DNA,利用免疫组化检测肝脏组织HBcAg的表达。结果发现,对于C57BL/6小鼠,三种不同剂量rAAV8-1.3HBV注射均可造成100%小鼠出现HBV持续感染;血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA以及肝组织HBcAg稳定表达超过8个月,其表达水平随重组病毒注射剂量的增加而升高,高剂量注射时可造成超过40%的肝细胞感染HBV,血清中HBV DNA可达105 IU/mL以上;未检测到针对HBV的抗体。对于BALB/c小鼠,三种不同剂量rAAV8-1.3HBV注射也可造成100%小鼠出现HBV持续感染;血清HBeAg和HBV DNA以及肝组织HBcAg稳定表达超过8个月,但是血清HBsAg在重组病毒注射2周之后显著下降甚至消失;在中剂量注射组的BALB/c小鼠血清中检测到低水平的Anti-HBs;血清HBeAg和肝组织HBcAg的表达水平随重组病毒注射剂量的增加而增高,并且各剂量组表达水平均高于C57BL/6小鼠,高剂量注射时可造成超过50%的肝细胞感染HBV。本研究表明,低至4×109 vg剂量的rAAV8-1.3HBV注射即可造成C57BL/6和BALB/c两种品系小鼠出现HBV持续感染,并且HBV复制水平随重组病毒注射剂量增加而增高;BALB/c小鼠对HBV的免疫反应强于C57BL/6小鼠,可以产生针对HBsAg的体液免疫反应而使血清HBsAg转阴,但无法清除携带HBV的肝细胞。     

应用慢病毒载体携带HBV基因组DNA制备乙型肝炎病毒感染小鼠模型的影响因素分析

应用慢病毒载体构建不同HBV转导质粒,通过高压水动力法尾静脉注射小鼠,比较不同HBV转导质粒、剂量(5μg和10μg)、小鼠品系(Balb/c和C57BL/6)及鼠龄(6周龄和18周龄)对建立HBV感染模型的影响。不同的时间点尾静脉采血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg的表达水平及动力变化,Real-time PCR检测血清及肝组织病毒载量;免疫组织化学法检测肝组织HBcAg的定位与表达。1.3倍HBV基因组慢病毒载体转导质粒(pCSHBV1.3)优于1.1倍与1.2倍HBV基因组转导质粒(pCS-HBV1.1or pCS-HBV1.2);pCS-HBV1.3注射Balb/c小鼠后抗原表达维持时间短,抗体出现早;pCS-HBV1.3注射C57BL/6小鼠后,HBsAg、HBeAg抗原表达及血清HBV DNA水平维持时间长;且注射5μg质粒相对于10μg质粒注射小鼠后抗原表达维持时间更长;而6周龄和18周龄小鼠血清均可在较长时间内检测到HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达,但在注射后35周内,前者的表达量均高于后者;所有注射质粒的小鼠肝组织中均可检测到HBcAg的表达,且在血清HBV感染标志转阴时均可检测到肝内HBV DNA的存在。注射质粒的HBV基因组长度、剂量以及宿主的遗传背景均对建立乙肝成体转基因小鼠模型有影响,且发现以5μg含1.3倍HBV基因组的转导质粒pCS-HBV1.3注射6周龄C57BL/6小鼠,HBV抗原表达和HBV DNA水平维持时间长,更适合建立HBV持续感染模型。     

NIRF对HBV复制的影响及其对组蛋白H3乙酰化水平的修饰

为研究NIRF(Np95/ICBP-90 like RING finger protein)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的复制以及与乙型肝炎病毒共价环状闭合DNA(HBV cccDNA)结合的组蛋白H3乙酰化的影响,采用脂质体转染将pGEM-HBV1.3+pFLAG、pGEM-HBV1.3+pFLAG-NIRF、pGEM-HBV1.3质粒分别转入HepG2细胞,Western blot检测NIRF蛋白的表达,用ELISA结合RT-PCR检测HBsAg、HBeAg以及HBV cccDNA的量并同时说明HBV在细胞内是完成完整复制表达的,采用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法检测与HBV cccDNA结合的组蛋白H3以及H3乙酰化水平的动态变化。结果显示,NIRF蛋白下调HBV标志物HBeAg、HBsAg的分泌以及HBV cccDNA的表达,表明其对HBV复制具有抑制作用;组蛋白H3及乙酰化的组蛋白H3都与HBV cccDNA的动态变化水平呈现相似的平行性,而NIRF蛋白也明显抑制组蛋白H3的表达水平和乙酰化水平。结论证实NIRF不仅能抑制HBV在肝癌细胞中的复制,而且能下调与HBV cccDNA结合的组蛋白H3和乙酰化组蛋白H3的表达。期待NIRF能为后续的HBV致病机理、HBV复制表观遗传学水平研究及有效抗病毒药物的研究与开发提供理论上的支持与帮助。     

乙肝患者肝组织乙型肝炎病毒cccDNA和血清MIF表达的相关性研究

目的:探讨乙肝患者肝组织乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)和血清巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)的表达相关性。方法:选择2016年2月到2016年7月在我院诊治的乙肝患者144例作为乙肝组,同期选择体格检查健康者144例作为对照组,采集所有入选者的血清样本,检测血清MIF、谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamic pyruvic aminotransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)的表达,并对乙肝组患者肝组织HBV cccDNA采用荧光定量PCR技术检测表达分析,直线相关分析乙肝组的血清HBV cccDNA表达量与血清ALT、TBi L、AST、MIF含量相关性。结果:乙肝组的血清MIF、ALT、TBi L、AST含量均明显高于对照组(P0.05)。乙肝组的肝组织HBV cccDNA阳性率为54.17%(78/144)。直线相关分析显示乙肝组的肝组织HBV cccDNA表达量与血清ALT、TBi L、AST、MIF含量均呈现明显正相关性(P0.05)。结论:乙肝患者体内血清MIF水平明显升高,伴肝组织HBV cccDNA的表达也升高,两者存在明显的正相关性。因此检测血清MIF水平有助于评估乙肝患者HBV的感染情况。     

NIRF可抑制乙型肝炎病毒在水动力法转染HBV小鼠模型中的复制及表达

目前对NIRF(Np95/ICBP-90 like RING finger protein)的研究正朝着细胞癌变进程以及表观遗传学的方向发展,但在体内NIRF对乙型肝炎病毒(HBV)的复制及表达的影响,目前尚不明确.通过高压水动力法转染HBV小鼠模型,不同时间点收集血液和肝组织标本,荧光定量PCR检测血清及肝组织中病毒载量,WesternBlot检测肝组织HBc(hepatitis B virus core protein)表达,ELISA检测血清HBeAg表达,并通过免疫组化染色检测HBsAg、HBcAg在肝组织中的定位及表达.小鼠转染pAAV-HBV1.3和NIRF以后,血清及肝组织病毒载量降低(n=3,P<0.05),HBc蛋白及HBV相关抗原的表达受到抑制,说明在水动力法转染HBV小鼠模型中NIRF对HBV的复制及表达起到抑制作用,期待能为后续的HBV致病机理及治疗药物的研究与开发提供支持与帮助.     

重访乙型肝炎病毒感染肾脏的意义

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)嗜肝性主要由病毒与受体作用的特异性、支持共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)形成的宿主因子和促进病毒RNA转录的核因子3种因素决定。人的肾脏很可能也提供这些要素,且许多研究发现HBV感染标记存在于慢性乙型肝炎患者的肾脏细胞中。本文探讨了HBV感染肾脏的可能性。由于目前血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)消失是功能性治愈慢性乙型肝炎的关键指标,如果肾脏也是HBV感染、表达和复制的另一靶器官,则肾脏在功能性治愈慢性乙型肝炎中的作用不可忽视。     

免疫抑制剂地塞米松可明显延长乙型肝炎病毒抗原在水动力法转染HBV小鼠模型中的表达

建立基于高压水动力法的乙型肝炎病毒(HBV)转染小鼠模型,并进一步建立和优化乙肝动物模型研究方法。首先构建了含腺相关病毒倒转末端重复序列元件与包含1.3个拷贝HBV基因组(ayw亚型)的HBV表达质粒(pAAV-HBV1.3);并将pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射C57BL/6小鼠,不同时间点采集血液和肝组织标本,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg表达;Real-time PCR检测血清及肝组织病毒载量;HE染色、免疫组化染色检测肝组织病理学改变及病毒抗原在肝组织中的定位及表达;最后采用免疫抑制剂地塞米松注射液(DEX)腹腔注射小鼠,建立免疫功能抑制小鼠模型,在此基础上制备乙肝病毒转染小鼠模型,并进行血清HBsAg、HBeAg检测。结果是正常免疫状态下,小鼠转染pAAV-HBV1.3 10d时血清及肝组织HBV相关抗原阳性,30d后HBV相关抗原检测阴性,但30d和60d血清及肝组织病毒载量检测均为阳性,且与对照组差异显著(P0.01,P0.05);经地塞米松注射后处于免疫抑制状态下的高压水动力法建立的乙肝病毒转染小鼠,则在60d仍可检测到HBsAg、HBeAg的表达。以上结果表明通过高压水动力法建立了急性乙肝小鼠模型,通过抑制小鼠免疫状态,可延长病毒在小鼠体内存留时间。该模型建立为HBV疫苗评价、药物开发及乙肝相关致病机理研究奠定了基础。     

重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN对转基因小鼠的免疫治疗效果

目的利用免疫耐受的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)转基因(Transgenic mice,Tg)小鼠模型,研究重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN的免疫治疗效果,为HBV的临床免疫治疗提供思路和依据.方法重组HBsAg疫苗单独或辅以CpG ODN,同时设干扰素(IFN)药物组和生理盐水(NS)照组,多次免疫治疗HBV转基因小鼠,于免疫前和末次免疫后2周、4周眼球后静脉丛取血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、HBsAg阴转率、Anti-HBs阳性率和HBVDNA拷贝数的变化.在治疗后应用HE染色观察各组小鼠肝组织病变活动度以及SP组化法观察活肝组织中HBsAg表达量的改变.结果在免疫治疗后2周,HBsAg疫苗组和HBsAg CpG组血清中的HBsAg量较免疫前和同期的IFN组、NS组均有明显降低(P＜0.05),并且到4周时降低作用依然很明显;免疫治疗后2周时两组100%出现Anti-HBs抗体;HBsAg CpG组治疗后2周血清HBsAg有1只转阴,4周时阴转数增加到3只.其他三组中均无阴转;免疫治疗后2周至4周HBsAg CpG组的小鼠HBV DNA的拷贝数可降低1～2个数量级,IFN组2周部分出现轻微降低但到4周时出现回升;HBsAg CpG组肝组织中HBsAg量的表达均出现不同程度的降低;病理学检测显示HBsAg CpG组肝组织中浸润大量淋巴细胞,可见恢复期的肝小叶.肝组织病变活动度情况为HBsAg CpG组＞HBsAg组＞IFN组、NS组.结论CpG ODN增强重组HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠的免疫治疗效果.重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为临床上免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.