普通烟草K^＋通道基因NKT4的克隆、序列和表达分析

通过比对拟南芥、胡萝卜、番茄和马铃薯的K+通道氨基酸序列得到了保守序列,设计1对简并引物,利用RT-PCR获得3条490bp的普通烟草K+通道基因中间片段.以其中一条中间片段设计特异性引物,应用RACE方法得到5′末端和3′末端cDNA序列.通过拼接并结合全长克隆及测序验证,获得一个未报道的普通烟草K+通道基因,并将其命名为NKT4(GenBank登录号为FJ233071).NKT4的cDNA全长为2937bp,其中5′非编码区45bp、编码区2679bp、3′非编码区213bp;编码区编码892个AA.构建了一个烟草、拟南芥及相关植物K+通道蛋白的系统进化树.基因表达分析表明,NKT4主要在烟草主根和侧根中表达,在烟草叶中也有少量表达.     

水母雪莲红色细胞系类黄酮含量和相关基因表达

水母雪莲为中国传统名贵中药,具有散寒除湿、活血通经、抗炎、镇痛等功效,其主要药用成分为类黄酮化合物。以水母雪莲白色系愈伤组织和经低温、高糖、强光诱导得到的红色系为材料,比较不同细胞系中类黄酮活性成分、结构基因和转录因子表达的差异。结果表明,红色系中总黄酮含量为白色系的3.60倍;重要的药用成分为芦丁,其含量达到干重的0.25%,是白色系的2.40倍;红色系中花青苷含量极高,矢车菊素3-O-己糖苷和矢车菊素3-O-琥珀酰己糖苷的含量分别达到干重的0.12%和0.19%;红色系中CHS、F3'H、FNS、FLS、DFR和ANS基因的表达均明显高于白色系;红色系中转录因子MYB、bHLH和WD40的表达也均明显高于白色系,其中MYB的表达量为白色系的19.70倍,说明红色系中转录因子的高水平表达增强了结构基因的表达,进而提高了类黄酮的合成。红色系中bHLH和WD40表达水平相似,而与MYB的表达水平相差很大,推测可能在水母雪莲中bHLH和WD40两种转录因子形成二元复合体后,和MYB共同调控类黄酮合成途径中结构基因的表达。     

牡丹开花相关基因PsAP1的克隆与表达

APETALA1基因对花器官的形成具有重要作用,并且能够调节花期.以牡丹品种赵粉(Paeoniasuffru-ticosaL.cv.Zhaofen)为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了1个牡丹APETALA1基因cDNA全长,命名为PsAP1,GenBank登录号为HM143943.其cDNA全长1103 bp,包含130 bp的5′非编码区、244 bp的3′非编码区和1个长度为729 bp编码242个氨基酸的开放阅读框.序列比对和系统进化分析表明,PsAP1与葡萄的亲缘关系最近,相似性达80%以上,属于MADS家族AP1/SQUA亚家族.相对荧光定量PCR分析表明,PsAP1在花瓣中的表达量最高,在雄蕊中表达量最低.     

水母雪莲通气组织形成的相关基因SmLSD1克隆及表达

该研究以水母雪莲为实验材料,通过RT-PCR结合RACE技术克隆了通气组织形成相关基因SmLSD1(GenBank登录号为OL690334),并对该基因在不同胁迫下的表达量及编码蛋白结构进行测定分析。结果表明：(1)水母雪莲SmLSD1基因全长965 bp,包含537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸。(2)同源序列比对发现,水母雪莲SmLSD1蛋白与菊科植物牛蒡LSD1的氨基酸序列相似性最高,达到98.31%。(3)亚细胞定位显示SmLSD1基因主要在细胞核和细胞膜上表达;原核表达显示,SmLSD1基因编码氨基酸的分子量约为18 kD。(4)荧光定量分析显示,SmLSD1基因在根、茎、叶中均有表达,且在叶片中表达量最高;在低温、低氧及紫外胁迫下,SmLSD1基因的表达量下调。研究推测,SmLSD1基因在水母雪莲通气组织的形成以及对逆境胁迫的响应中发挥着重要作用。     

金黄色葡萄球菌特异性PCR检测靶点的自动化筛选

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。     

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

根据棉花纤维特异表达cDNA文库得到的咖啡酰辅酶 A-O-甲基转移酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT2.GhCCoAOMT2基因cDNA(GenBank登录号为FJ376606)具有一个747 bp的开放阅读框,5′非编码区为12 bp,3′非编码区为243 bp,编码248个氨基酸,预测分子量约为28.023 kD,等电点为5.39.GhCCoAOMT2基因组序列长度为1 442 bp,包含4个外显子和3个内含子.氨基酸同源分析发现,GhCCoAOMT2与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,GhCCoAOMT2基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高.原核表达分析表明,最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG在37℃下诱导6 h.     

水母雪莲Myb转录调控因子SmP基因的克隆及序列分析

采用TDPCR(Touch down PCR)法从水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)红色系愈伤组织cDNA文库中筛选并克隆了雪莲Myb转录调控因子SmP (S.medusa Maxim Mybrelated P gene)基因。序列分析表明该基因全长969bp,包括一个771bp的完整开放阅读框架（ORF）,编码一个256氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列的同源性分析表明在N-端具有两个典型的R2R3-Myb-DNA结合结构域。C-端富含亲水的丝氨酸S(18.38%),且以寡聚体的形式存在,具有转录调控因子激活结构域常见的特征。     

草鱼α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长克隆与表达分析

采用RACE技术获得α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长序列为1 469 bp,开放阅读框为1 329 bp,可编码442个氨基酸。5′非编码区长19 bp,3′非编码区长121 bp。核苷酸序列分析表明,在N端可能存在一个由1～21位氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是虹鳟;在系统进化上,与在斑马鱼、虹鳟共聚为一个大支。用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼α1-抗胰蛋白酶基因在不同组织中的表达分布。结果显示:正常情况下,草鱼α1-抗胰蛋白酶在肝脏表达最丰富,在脾脏、前肾、前肠、中肠、后肠和也有少量表达;细菌诱导下,肝脏中表达最强,前肾、脾脏、肠道中表达均明显提高,心脏和后肾中也出现较高表达。提示α1-抗胰蛋白酶可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答。     

橡胶树胞质型谷胱甘肽还原酶基因的克隆与表达分析

根据橡胶树GR1基因（Hb GR1）部分序列设计特异引物,运用RACE和RT-PCR技术克隆Hb GR1全长c DNA序列;运用DNAMAN、MEGA 6.06、Prot Param及Signal P 4.1 Server等生物信息学软件对Hb GR1序列、GR1系统进化关系及Hb GR1的基本理化性质和亚细胞定位等进行分析;利用实时荧光定量PCR技术研究Hb GR1的表达模式;构建原核表达载体p EASYE1-Hb GR1,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导融合蛋白原核表达。获得2 082 bp的Hb GR1全长c DNA,其中5′非编码区293 bp,3′非编码区298 bp,开放阅读框长1 491 bp,共编码496个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为53.68 k Da,理论等电点p I为6.18。序列分析发现Hb GR1无信号肽,在氨基酸水平上与其他植物GR1具有很高的同源性,包含植物GR典型的NADH结合结构域、二聚体结构域和高度保守的GGTCV[I/L]RGCVPKK[I/L]LVY基序。对植物GR进行系统进化分析表明,Hb GR1属于双子叶植物GR分枝,与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明Hb GR1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达;Hb GR1表达受死皮、乙烯、茉莉酸、过氧化氢和伤害调控。SDS-PAGE电泳结果表明重组质粒p EASY-E1-Hb GR1在大肠杆菌BL21（DE3）中有效表达一个分子量约为55 k Da的融合蛋白。     

甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx1原核表达、纯化及酶学性质分析

【目的】谷氧还蛋白(glutaredoxin, Grx)是生物体内依赖硫醇的抗氧化酶,在生物氧化胁迫和细胞凋亡等许多重要的生命活动中发挥作用。本研究旨在测定甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氧还蛋白家族成员SeGrx1的基因序列以及酶催化反应特性,为揭示其在昆虫体内功能奠定基础。【方法】以前期获得的甜菜夜蛾转录组数据为基础,采用RACE-PCR技术克隆甜菜夜蛾Grx1基因cDNA全长序列。将甜菜夜蛾Grx1基因的ORF序列连接至pET-16b原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中,IPTG诱导融合蛋白表达后用镍柱和Superdex75/200分子筛纯化;采用荧光酶标仪测定纯化的SeGrx1的活性及酶促反应动力学参数。【结果】甜菜夜蛾SeGrx1基因(GenBank登录号:MK318813) cDNA全长738 bp,其中5′非编码区长40 bp,3′非编码区长347 bp,开放阅读框(ORF)全长351 bp,编码116个氨基酸,预测蛋白的相对分子量为12.57 kD,活性位点为CPYC,为双巯基谷氧还蛋白。SeGrx1中心由4个平行和反...     

水母雪莲查尔酮合酶基因的克隆、表达及酶活分析

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白具有查尔酮合酶活性,可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮。     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp的全长cDNA序列。编码428个氨基酸。其中96—174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现。它们的同源性高达75％以上,显示soz9基因在进化中较保守。应用半定量RT—PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析。结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。     

Cloning of a cDNA encoding the Saussurea medusa chalcone isomerase and its expression in transgenic tobacco.

Chalcone isomerase (CHI; EC 5.5.1.6) is a key enzyme in the flavonoid biosynthesis pathway. We isolated a CHI gene (SmCHI) from a cDNA library derived from Saussurea medusa (Asteraceae) cell cultures. The cDNA and genomic sequences of SmCHI are the same; in other words, this gene is intronless. The coding region of the gene is 699 bp long, and its deduced protein consists of 232 amino acids with a predicted molecular mass of 24 kDa and a pI of 4.7. The deduced amino acid sequence of SmCHI shares 79.3% identity with CHI from Callistephus chinensis, a familial relative to S. medusa; this homology is higher than those with CHI's from any other plant species. A functional bioassay for SmCHI was performed by transforming Nicotiana tabacum plants in the sense or antisense orientation under the regulation of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. Transgenic tobacco plants overexpressing sense SmCHI produced up to fivefold total flavonoids over wild-type tobacco plants, mainly due to an enhanced accumulation of rutin. Transgenic tobacco plants with antisense SmCHI accumulated smaller amounts of flavonoids; this is apparently brought about by suppressed expression of the endogenous CHI gene. CHI activities also positively correlated with the amounts of total flavonoids accumulated in the transgenic plants. It is concluded that overexpression of SmCHI can be used as a useful approach to increase flavonoid production in transgenic plants.     

籽粒苋中PPDK基因的克隆及表达特性分析

为寻找能提高植物光合效率的基因资源,以高光效植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus L.)为试材,利用同源克隆和RACE技术克隆了丙酮酸磷酸二激酶(Pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)基因,基因cDNA全长为3 224 bp,其中5′非翻译区为71 bp,阅读框为2 868 bp,3′非翻译区为285 bp,推导的蛋白质为956个氨基酸,分子量约106 kDa。序列分析表明,克隆的基因含有PPDK基因的功能结构域。表达模式分析显示克隆的PPDK基因在绿色组织中特异表达,为PPDK基因的长转录本,初步确定已克隆得到为籽粒苋中的PPDK基因,将其命名为AhPPDK。     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp 的全长cDNA序列,编码428个氨基酸。其中96-174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现,它们的同源性高达75%以上,显示Sox9 基因在进化中较保守。应用半定量RT-PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析,结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。     

光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的昆虫热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70) 基因的保守序列设计引物,利用PCR结合RACE扩增的方法,获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita borealis热休克蛋白70基因,命名为APhsp70 (GenBank注册号为EF569673)。测序结果表明,序列长为2 092 bp,由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kD,含653个氨基酸残基。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。通过Northern blotting和半定量RT-PCR技术研究昆虫在受到不同温度胁迫时该基因的表达规律,结果表明：在45℃处理时,昆虫体内该基因的表达水平显著上升。并且,当机体受到-5℃低温胁迫并在室温恢复15 min后APhsp70的表达量也显著升高;但是4℃和-10℃低温处理组APhsp70的表达未见明显变化。     

丝颖针茅ScTIP1;1基因的克隆及对非生物胁迫的应答

利用丝颖针茅(Stipa capillacea Keng)一条EST序列并结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆了丝颖针茅的一个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因ScTIP1;1的全长编码区序列。该基因开放阅读框长度为753 bp,编码250个氨基酸,其蛋白质分子量为25.8 kD,理论等电点为6.16;序列比对及系统进化分析表明,ScTIP1;1和拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTIP1;1蛋白的亲缘关系较近;亚细胞定位结果显示,该蛋白位于液泡膜上;实时荧光qRT-PCR检测表明,盐、干旱及低温胁迫可诱导ScTIP1;1基因的表达,且低温处理后基因的表达量变化最为明显。本研究结果为理解丝颖针茅的生态适应性提供了理论依据。