大肠杆菌中依赖于DNA的RNA聚合酶的提取

在细菌和其他动植物细胞中都普遍存在着一种以DNA作为模板,利用四种核糖核苷三磷酸作为底物来合成RNA的酶,这种酶叫做依赖于DNA的RNA聚合酶[E.C.2.7.7.6]。从细菌中提取这种酶的方法不少,但以Cham-berlin和Berg以及Burgess的方法使用最为普遍。我们主要参照Burgess氏的方法以大肠杆菌K12(E.coli K 12)中提取RNA聚合酶,并稍加改变。     

大肠杆菌表达的TaqDNA聚合酶的纯化

Taq DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的热稳定DNA聚合酶之一,与其他热稳定DNA聚合酶具有相似的特征,其纯化策略不但有潜在的应用前景,也对同类聚合酶的分离具有指导意义。已报道的适宜大量制备Taq酶的方案所需成本较高,而文章介绍了一种利用国产阳离子交换树脂廉价制备Taq酶的方案。在本方案中,采用热变性、(NH4)SO4沉淀与724离子交换层析分离大肠杆菌表达的Taq酶,约18 g Na型树脂干粉一次可回收比活约8 131.98 U/mg、总酶活2.2×105U、近27.07 mg Taq酶。纯化的产率可达48.92%,纯化倍数约59.35。所制酶SDS-PAGE电泳只检测到94 kDa单一蛋白条带,未检测到DNA核酸酶污染,与商品酶的PCR扩增能力无区别。此纯化方法成本低,适合实验室一般性的制备和生产应用。     

鸭乙型肝炎病毒复制复合体中内源性DNA聚合酶测定方法的建立及其应用

应用~3H-TTP作为放射性掺入底物,建立了鸭乙型肝炎病毒复制复合体(DHBVRCs)内源性DNA聚合酶的测定方法,研究了该酶的生化特性,试验了12种药物对该酶的抑制作用。结果该方法测定的内源性DNA聚合酶为DHBV特异的,其活性依赖于4种dNTP和Mg~ ++的存在。最适Mg~++浓度为20mM。NP-40可刺激其活性。放线菌素D仅能抑制其30％的活性,膦羧基甲酸钠(PFA)、膦羧基乙酸钠(PAA)和苏拉明可抑制此酶,它们的半数抑制浓度分别为8.5μM、860μM和9.25μM。而Ara-AMP等几种药物对该酶无抑制作用。应用放射性掺入电泳自显影法证明,PFA对DHBV RCs中依赖DNA和RNA的DNA聚合酶均有显著的抑制作用。     

Pfu DNA聚合酶的表达条件优化及纯化研究

Pfu DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的高保真DNA聚合酶之一。本研究对重组菌株的Pfu酶基因表达条件进行优化,以提高Pfu DNA聚合酶的表达效率。通过在菌液深度OD600=0.87时加入1.5 mmol/L的IPTG进行诱导培养,诱导培养时间为11.03 h,用酶溶法对重组菌株进行破胞提取粗酶液,经热变性法与盐析沉淀法对杂酶进行纯化,最后经过透析后得到纯酶。采用考马斯亮蓝G-250法对酶进行含量测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,最后使用PCR反应检测提纯后的Pfu酶的活性。结果表明优化处理后制备的Pfu DNA聚合酶,其纯度、酶活性和酶特异性均达到市售的Pfu DNA聚合酶水平。本研究为Pfu DNA聚合酶的开发和利用奠定了基础。     

Bst DNA聚合酶大片段在全基因组扩增中的应用

Bst DNA聚合酶大片段作为一种常用的DNA聚合酶,因其独特的特点:能引发链置换反应、高保真、耐高温等,而成为一种重要的DNA多重置换扩增酶。目的:为减少成本,设计一种高产,方便且扩增活性高的Bst DNA聚合酶大片段表达体系;探究该酶应用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增条件。方法:采用p TWIN1质粒作为载体克隆表达Bst DNA聚合酶大片段,应用几丁质亲和层析柱纯化该酶,使用该酶对人类基因组DNA进行不同温度下扩增,探究其最适反应温度,并据此对胃癌石蜡包埋组织基因组DNA进行扩增。结果:由此得到的Bst DNA聚合酶大片段能运用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增,扩增效率可达200倍,并能应用于a CGH芯片。结论:扩增得到保真性高,覆盖基因组范围大的DNA扩增产物。该应用与a CGH结合,使得对少量的癌症石蜡包埋组织DNA样本进行全基因组扩增,并进行其基因拷贝数变异研究成为可能。     

DNA聚合酶Ⅰ

1957年科恩伯格(A.Kornbeng)通过测定放射性标记的[~(14)C]胸苷三磷酸参入DNA的能力,发现一种催化DNA合成的酶。这种酶现在叫做DNA聚合酶Ⅰ或Pol Ⅰ,为含有928个氨基酸残基的多肽单链。酶促反应的底物是4种脱氧核苷三磷酸。反应需要DNA模板和一小段与模板互补的多核苷酸引物。反应中,引物或生长中DNA链的3′羟基与新参入核苷酸的α-磷酸基结合。反应     

一种简便快速的聚合酶活性实时检测新方法

基于双链DNA结合染料能特异嵌入双链DNA发出荧光的原理,发展了一种实时检测DNA聚合酶活性的简便方法.在检测过程中,聚合酶的聚合反应进程被实时转换为荧光信号,通过监测荧光强度的变化实时检测聚合酶的活性及药物对聚合酶活性的影响.该方法不需要对DNA进行放射性同位素标记和荧光标记,也不需要聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚合酶链式反应,是一种简便、快速的聚合酶活性实时检测新方法,为研究抗肿瘤药物对聚合酶活性的影响提供了一种简捷方法,也将为相关疾病诊治和药物筛选提供一种新的思路.     

DNA连接酶、RNA连接酶、多核苷酸激酶和DNA聚合酶的同时分离纯化

本文报道从T4amN82噬菌体诱导的大肠杆菌E.coliB 同时分离和纯化四种酶的一般方法。先用硫酸链霉素沉淀把RNA连接酶,DNA连接酶与多核苷酸激酶和DNA聚合酶加以分离。然后用DEAE纤维素柱层析把DNA连接酶与RNA连接酶加以分离,用DEAE-Sephadex-A50柱层析把多核苷酸激酶与DNA聚合酶加以分离。本文着重介绍T4DNA聚合酶的分离纯化。     

三种人全血基因组DNA提取方法的比较

目的：比较改良酚一氯仿抽提法、盐析法、试剂盒法从人全血中提取基因组DNA的效果,以期建立一种快速、经济的提取高质量基因组DNA的方法。方法：分别用上述三种方法从人全血中提取基因组DNA,通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应（PCR）、限制性内切酶酶切检测提取的基因组DNA的产量、纯度和质量。结果：改良酚一氯仿抽提法与试剂盒法提取的基因组DNA相比,DNA的产量有统计学差异,DNA的纯度无统计学差异,但试剂盒法提取的基因组DNA有较明显的降解现象：盐析法与改良酚．氯仿抽提法、试剂盒法相比,基因组DNA的产量和纯度都存在统计学差异,并且基因组DNA聚合酶链式反应（PCR）扩增的稳定性也明显劣于另外两种方法;三种方法提取基因组DNA均能进行限制性内切核酸消化。结论：改良酚一氯仿抽据取法是一种经济、快速、高效、稳定提取人全血基因组DNA的方法,适用于批量临床标本处理。     

过氧化氢酶基因定向进化文库的构建及其评价

采用易错聚合酶链反应和DNA改组技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶(CAT)基因的突变体文库,并随机对两种方法所得产物各5个样品做序列测定。序列分析结果表明突变率分别为0.329%和27.58%,易错聚合酶链反应体系的错配率可以比普通PCR体系提高约10倍,DNA改组的突变率则更高,但是难以避免由于突变率太高造成的目的基因无法正确翻译这一情况。另外,应用邻接法(neighbor-joining, NJ)对随机选择的过氧化氢酶基因突变体序列和野生型序列做核酸和蛋白质序列的NJ进化树,进化关系与突变率分析基本一致。     

聚合酶链反应-酶切分型鉴定广州地区环境水源军团菌

【目的】探讨聚合酶链反应-酶切分型在快速鉴定环境水源军团菌方面的应用价值,并了解广州地区环境水源军团菌的分布状况。【方法】对广州地区采集的44份环境水样,作军团菌分离培养,再对分离菌株进行16Sr DNA PCR-酶切分型鉴定、16S rDNA基因测序和mip基因测序鉴定。【结果】在广州地区环境水源分离的112株军团菌,经聚合酶链反应-酶切分型鉴定、16S rDNA基因测序和mip基因测序鉴定,检出嗜肺军团菌66株,非嗜肺军团菌46株,其中菲氏军团菌20株,戈氏军团菌17株,橡树岭军团菌7株,长滩军团菌2株。【结论】聚合酶链反应-酶切分型检测环境水源军团菌是一种简便、快速、特异的鉴定方法;在广州地区环境水源中普遍存在军团菌,主要是嗜肺军团菌,其次是菲氏军团菌,戈氏军团菌,橡树岭军团菌和长滩军团菌。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究I．酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B一12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含Dnase、Rnas：和蛋白酶活力,无内源．DNA。测定了RNA聚合酶A和c对弘鹅膏蕈碱的敏感性。酶A在a-鹅膏荤碱为400μg／ml时,活性受到抑制,而酶c在该浓度时,几乎不受抑制。(NH4)zSO4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40raM和240raM。无二价金属离子Mn+或Mg2+,酶A和c几乎无活力。两种酶最适Mn2+浓度均为2.5mM,Mg2+浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

人源DNA聚合酶δ研究进展

在真核生物染色体DNA复制过程中主要涉及三种DNA聚合酶:α(Polα),δ(Polδ)和ε(Polε)。人源DNA聚合酶δ是p125,p68,p50,p12四个亚基构成的异源四聚体,属于DNA聚合酶B家族,具有5’-3’聚合酶催化活性和3’-5’核酸外切酶活性,是染色体DNA复制过程中最主要的复制酶,同时还参与多种形式的损伤修复,在保证基因组结构的完整性和遗传稳定性方面具有重要的意义。由于其重要的生物学功能,目前引起人们更多的关注和重视。对人源DNA聚合酶δ的分离纯化方法及涉及DNA复制和损伤修复过程中酶学功能等方面的最新研究进展进行综述。     

利用Taq DNA聚合酶对PCR产物直接进行顺序分析

Taq DNA聚合酶具有反应速度快、温度作用范围广及良好的续进性等特点,可视为一种理想的DNA顺序分析酶。本文首先对非对称性PCR扩增过程中单、双链DNA产物的积累情况进行了分析,然后采用标记延伸二步法,对Taq DNA聚合酶的性质及影响因素进行分析。为进一步改进Taq DNA聚合酶测序的方法,本反应建立了“Klenow-型”的直接掺入标记同位素测序法,即在反应液中加入与标记核苷酸相应的一定浓度的冷dNTP。此法不但解决了二步法中引物后部分DNA顺序无法读出的缺点,而且简化了反应步骤,亦能得到令人满意的顺序分析结果,每次可读出至少400碱基的序列。     

中国科学院上海细胞生物学研究所1987年招考硕士研究生试卷(续)

3.在反馈抑制中,代谢的最终产物通常抑制合成代谢途径中(1)第一酶的基因(2)最后一个酶的基囚或(3)中间的酶的基因表达。 4.如果已知一个DNA分子的(A十T)/(G十C)的比例为1,你能否说出这是一个(1).双链,或(幼单链DNA分子,或(3)需要更多的信息。 5.在细菌中已发现了三种DNA聚合酶、三者都参与DNA的复制,进一步的研究成果表明(1) DNA聚合酶I,或(2) DNA聚合酶兀,或(3) DNA聚合酶皿。实际上是一个DNA的修复酶。 6.线粒体中的功能蛋白是完全由(1)线粒体的基因组编码的,(2)核内基因组编码的(3)还是由两者共同编码的。.真核细胞RNA聚合…     

焦磷酸测序技术其在分子生物学领域的应用

焦磷酸测序技术是一项新型DNA测序技术。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将引物上每个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的。操作中不需要电泳、样品标记和染色,具有高度的可重复性,并行性和自动化特点,本综述了焦磷酸测序技术的基本原理,测序过程和它在SNPs研究,病原微生物的快速鉴定、病因学分析、法医鉴定等方面应用。     

Pfu DNA聚合酶的制备过程及其条件优化

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可以方便、快捷、准确地大量复制目的基因片段,是分子生物学研究中不可或缺的技术手段。在PCR反应中,DNA聚合酶起着关键作用。Pfu酶(Pfu DNA polymerase)是DNA聚合酶的一种,具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性,可在聚合酶链式反应中纠正错误掺入的碱基,可以快速、高保真地扩增DNA片段,在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。本研究建立了一套Pfu聚合酶表达与纯化的详尽方案,该方案利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)作为诱导剂,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达Pfu酶,然后利用Ni-NTA柱层析纯化制备。研究中对IPTG诱导时间、细胞破碎条件、缓冲液类型及其p H、粗酶液热处理温度与时间、洗脱液中最佳咪唑浓度等重要条件和参数分别进行了优化确定。实验结果表明,使用该方案可以成功制备高产量高纯度的Pfu聚合酶,完全满足常规PCR反应的要求。本研究建立的实验方法和技术参数,十分适用于研究者小规模自主制备Pfu酶,对于有大量分子克隆要求的课题组,利用该方案自主制备Pfu酶能够显著节省科研成本。     

链替代扩增反应研究进展

链替代扩增反应作为一种体外恒温酶控扩增体系,主要基于限制酶打开缺口和无外切酶活性的DNA聚合酶的聚合替代的原理,随着该反应体系各环节的不断改进,目前该方法已应用于细菌尤其是分枝杆菌DNA的检测、体外进化模型的建立、核酸定量及芯片杂交等多个方面。