基因枪在水稻遗传转化中的应用及其转化技术的优化

1983年Zambryski等人用根瘤农杆菌介导法进行烟草基因转移,获得了世界上首例转基因植株.随后,应用DNA直接导入技术如电击法(electroporation)和PEG介导法(PEG—mediated)成功地获得了转基因水稻植株.近年来,随着基因枪技术的建立和发展,水稻遗传转化成功的报道逐年增多.目前基因枪技术在植物遗传转化中的应用超过了根瘤农杆菌介导和其它转化方法的应用.这是因为基因枪转化技术不受植物种类的限制,不需要以原生质体作为转化的受体,可以将外源基因直接导入细胞、组织或器官,因而克服了根瘤农杆菌     

基因枪的使用方法介绍

基因枪法是一种新型的遗传转化手段[1-3]。所谓遗传转化是指通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的基因组中,并使之在受体细胞中表达。人们可利用一个特定的目的基因,如抗虫、抗病基因等进行转化,使转基因植物在保持原有的各种优良农艺性状的同时,又能增加新的目的基因所控制的性状。一般遗传转化主要有两类：一类是农杆菌介导法,一类是DNA直接转化法。DNA直接转化技术包括化学方法和物理方法,如电击、微注射、超声波和基因枪法。基因枪法,又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法,是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞…     

通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株

通过PEG法将外源基因导入甘蓝(Brassica oleracea L.)下胚轴原生质体。以潮霉素和卡那霉素进行筛选,均成功地得到了抗性愈伤组织。对于潮霉素抗性愈伤组织,其绝对和相对转化频率分别为4.1×10~(-4)和1％～3％,在分化培养基上,抗性愈伤组织能够分化出芽。诱导生根后进行移栽,生长状况良好。Southem blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。对影响转化的一些因素进行了探讨。     

植物转基因方法概述

综述了植物基因转化的不同方法。植物基因转化方法主要包括直接基因转移和农杆菌介导的转化,直接基因转移又包括PEG介导、电激介导和基因枪方法。相比之下,农杆菌转化方法具有明显的优势;本文对其方法和机制作了较为全面的介绍。     

用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体再生转基因植株

通过PEG处理把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体。转化介质中二价阳离子的种类和浓度、携带DNA及PEG溶液的pH值都会影响基因导入效率。以潮霉素抗性和卡那霉素抗性作标记,均成功地筛选到了抗性愈伤组织。相对转化频率分别为1.3%和0.2%。前者明显高于后者。把抗性愈伤组织转到分化培养基上,分化出芽。诱导生根后移栽到土壤中,生长状况良好。酶活性测定和Southern blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。该遗传转化系统存在的主要问题是抗性愈伤组织分化频率较低。本文对其原因作了初步分析。     

胸腺肽基因多元植物表达载体的构建

Gus基因是最为常用的报告基因之一,为了便于对胸腺肽目的基因进行检测,在该研究中,胸腺肽目的基因、PRIB分泌基因和GUS报告基因DNA片段用DNA纯化回收试剂盒回收,然后用T4 DNA连接酶连接,构建成几个基因相融合的多元植物表达载体,并通过酶切进行鉴定。用基因枪转化法对胡萝卜愈伤组织进行了遗传转化,转化的胡萝卜愈伤组织经Southern杂交检测和X-Gluc染色,结果表明,多元表达载体成功地被导入胡萝卜愈伤组织。     

用无细胞克隆系统进行特异DNA扩增的技术—PCR

作为分子生物学基石之一的分子克隆技术,是一系列技术的总称,包括目的基因的提纯,选择有自主复制能力的载体DNA,选用不同的限制性内切酶,构建新的重组DNA,导入受体细胞,重组DNA的转化,转化后遗传物质和性状的转移及重新组合,重组DNA的纯化扩增等。该系列技术的操作相当复杂繁琐且耗时长。如何从极微量的生物材料中简便快速地得到大量特定的基因,或是在众多复杂的生物基因DNA中,     

基因枪法和农杆菌介导法对水稻转基因拷贝数的基因重排概率的影响

基因枪法和农杆菌介导法转化的外源DNA整合到植物梁色上是随机进行的,因此,它们可能会产生不同的转基因拷贝数,得到不同的基因表达盒完整率,这反过来会影响基因的表达,为证实这一假说,作首先将同一质粒pAcPG-CAM分别用基因枪法和农杆菌介导法转化到水稻（Oryza sativa L.cv.TNG67)愈伤组织,为了揭示不同质粒是否也出现类似结果,也用农杆菌介导法,基因枪法分别将pTOK233和pJPM44导入水稻愈伤组织,并获得一批转基因植株,Ｒ０代值转基因表达的分析用ＧＵＳ组织化学染色法,用质粒上的单切点酶酶切基因组DNA后的Southern杂交结果确定转基因拷贝数,总DNA髟双切点酶（分别位于表达盒两侧）酶切后的Southern杂交结果确定了完整转基因表达盒数目,结果表明,农杆菌介导转化法的转基因植株的转基因拷贝数相对少一些（平均为2．1和2．3）,而基因枪法转化产生的转基因植株的转基因撬贝数相对多一些（平均为4．2和5．6）,并且农杆菌介导转化法的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率低于由基因枪法转化产生的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率－农杆菌介导转化法的DNA重排概率为0．07和0．106,由基因枪法转化的DNA重排概率为0．57和0．66。研究还分析了基因表达情况与转基因的拷贝数或完整表达盒数之间的关系,GUS定量分析结果表明,为了准确揭示转基因的表达情况与转基因之间的关系,用完整基因表达盒数而不是转基因DNA拷贝数更准确,并于用不同转基因方法将同种质粒导入植物体分析基因表达盒DNA重排概率为首次报道。     

花粉介导法获得玉米转基因植物株

利用花粉作为外源基因的载体进行遗传转化在玉米（Zea mays L.）上获得了成功。以玉米自交系太9101、综31等为受体,以pGLⅡ-RC-1质粒为供体,在玉米开花期,用花偻与质粒DNA混合并附加超声波处理,然后辅以人工授粉的方法将个源基因导入到受体中。DNA斑点杂交和PCR扩增以及PCR－Southern blot杂交检测结果证明,几丁质酶基因确已导下玉米自交系中。所得结果表明：玉米花粉可以介导外源基因的转化。利用花粉作为载体介导外源基因转化,避免了传统的基因枪法和土壤杆菌法转化所要求的组织培养技术,转化方法简单,易操作,具有很强的实用性。     

谷类植物原生质体研究的重要进展

自1986年以来,已从所有重要的谷类植物,包括小麦、水稻、玉米和大麦,以及多种禾本科植物例如甘蔗的原生质体再生得到了完整的再生植株。此外,在一些实验室中已得到了谷类植物的体细胞杂种或胞质杂种以及一些带有引入的有用农艺性状的转基因植株。在过去的十年期间,由于两种关键性的技术进步:即建立胚性悬浮培养物作为分离全能性的原生质体的材料以及将外源DNA直接导入原生质体的技术     

用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体再生转基因植株

通过ＰＥＧ处理把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体。转化介质中二价阳离子的种类和浓度、携带ＤＮＡ及ＰＥＧ溶液的ｐＨ值都会影响基因导入效率。以潮霉素抗性和卡那霉素抗性作标记,均成功地筛选到了抗性愈伤组织。相对转化频率分别为１．３％和０．２％。前者明显高于后者。把抗性愈伤组织转到分化培养基上,分化出芽。诱导生根后移栽到土壤中,生长状况良好。酶活性测定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明外源基因已插     

影响绿豆下胚轴原生质体遗传转化的因素

采用共培养法和ＰＥＧ法将外源基因导入绿豆下胚轴原生质体中,得到转化愈伤组织。根癌农杆菌经乙酰丁香酮等诱导物质以及低ｐＨ,低ＰＯ４＾３－预培养后,细菌Ｔ－ＤＮＡ的转移受到促进,ＧＵＳ基因表达活性明显提高。在ＰＥＧ介导的绿豆原生质体转化中,高Ｃａ＾２＋／ｐＨ有利于外源ＤＮＡ转移到植物细胞,ＧＵＳ活性较高。此外,质粒ＤＮＡ浓度和启动子类型均对外源基因的转移和表达有一定影响。     

外源DNA直接导入受体植物的研究进展

外源DNA直接导入技术以DNA片段杂交假说为理论基础,直接将带有目的性状的供体遗传物质（总DNA）或目的基因导入受体植株,创造大量的变异材料,通过筛选获得目的性状的后代,达到改良品种的目的。由于其简单、易行、不受受体植物种类的限制,已被越来越多的育种工作者所接受,并在水稻、小麦、棉花、大豆、玉米以及蔬菜等方面得到广泛的应用,为农业生产培育出了一些抗病、抗虫及其它优良性状的新品种及新品系,有利地推动了植物分子育种的研究进程。     

赤霉菌原生质体DNA转化

DNA转化是基因表达和其它分子生物学研究的一项重要内容。原核生物（如细菌）的DNA转化技术已相当成熟,作为真核生物的丝状真菌其DNA转化过程要相对复杂一些,且转化效率一般也不如细菌的高。但丝状真菌DNA转化的研究对于深入探讨真菌基因表达调控的机理、尤其是研究外源基因在丝状真菌中的表达有着重要意义（唐国敏,1992）。赤霉菌（Gibberellajirjtheroi）在实验室条件下易培养、生长快,是研究赤霉素储类生物合成途径的必需材料,在作为表达体系表达外源基因尤其是储类合成的关键基因方面亦有着潜在的用途。但作为赤霉菌基础研究…     

用土壤杆菌确立了玉米性状转化技术

日本烟草产业(JT)遗传育种研究所研究员石田祐二等利用植物病原菌根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)确立了玉米性状转化技术,于7月15日在东京召开的组织培养学会发表。 以前利用土壤杆菌的基因导入技术(Agrobacterium法)是适用于向双子叶植物中导入基因的简便的导入法。但是不适用于向单子叶植物中(Agrobacterium不能作为宿主)导入基因。JT公司1994年开发了世界第一个使用土壤杆菌向单子叶植物水稻中稳定地导入基因的技术。这次确认用同样的方法也能向玉米中     

植物遗传工程研究进展

最近几年,DNA重组及其遗传操作技术的迅速发展,以及植物组织培养技术的日臻完善,为植物遗传工程的发展奠定了坚实的基础。将特定的外源基因引入到受体植物细胞,并使其定向而稳定的遗传,这是常规遗传育种方法所不能比拟的。植物遗传工程在发展农业、医学、环境等方面有着巨大的实际应用潜力,日益受到人们的重视。本文介绍一些转化体系,常用基因的特性及外源基因有效地表达及其调控的问题。     

农杆菌介导的单子叶植物遗传转化研究进展

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒转化系统的建立使植物遗传工程进入了一个飞速发展的时期。近年来,发根农杆菌(A.rhizogenes)Ri质粒毛根转化系统的研究十分迅速,展示了美好的前景,农杆菌介导的植物遗传转化已成为目前研究和应用最广泛的系统。但是,农杆菌的宿主范围一般仅限于双子叶植物和一些裸子植物,这就直接防碍着这种比较完善的基因转移技术在单子叶植物,尤其是禾谷类作物转化的应用。本文介绍了农杆菌介导的单子叶植物遗传转化的进展;对扩大农杆菌宿主范围、实现对单子叶植物转化的途径进行了探讨。 (一)农杆菌介导的单子叶植物转化的方法 目前建立的单子叶植物基因转移系统有:(1)农杆菌载体系统;(2)外源DNA     

外源DNA导入技术在植物育种中的应用

外源DNA导入技术,是植物分子育种的内容之一.它不同于目的基因分离、构建重组分子、装载体、转导的基因工程技术.它是以植物的植株为受体,直接将带有目的性状的供体遗传物质或供体的总DNA片段进行导入,最后筛选获得目的性状的后代,达到改良品种之目的.由于它简易可行,已引起了育种者极大的兴趣.近十多年来,这一技术已     

花粉管通道法转基因技术的细胞胚胎学机理探讨

本文从细胞胚胎学出发,从理论上对花粉管通道、花粉管通道法的转化机理进行了研究。认为,外源DNA进入胚囊的途径,即外源DNA沿着连接柱头与胚囊的花粉管外界面渗入胚囊;外源DNA转化的受体应为合子;外源DNA转化的时期应限定在精卵融合至合子分裂前这一段时期,此时合子细胞壁尚未封闭;外源DNA转化受体的机制可能是外源DNA与处于原生质体状态的合子的随机融合。强调在应用此方法时,应对植物雌蕊结构以及受精经历的时间有全面了解,并列出了一些重要植物授粉后受精过程各阶段的时间,对外源DNA导入部位和方法提出了建议,并分析了花粉管通道法转基因技术转化率较低的原因。     

红曲菌9903A转化体系影响因素的研究

采用PEG介导的原生质体转化方法,研究了将含有潮霉素抗性基因的质粒pMP-Hygro转入红曲菌9903A的影响因素。实验结果表明,原生质体转化最佳条件为:1.0mol/L的山梨醇为渗透压稳定剂;以含有50mmol/L的Ca2 和最终质量分数为40%的PEG4000为转化介质;最佳原生质体浓度和载体DNA用量分别为1×108个/mL、1μg/100μL原生质体;原生质体再生培养基采用不含无机盐的培养基,再生方式采用原生质体液涂布单层再生培基平板法。得到的平均DNA转化率可达160个/μgDNA。本文所研究的PEG介导的原生质体转化方法可以较好的向红曲菌细胞导入外源DNA,并使外源DNA在红曲菌细胞内大量表达。