人Leptin基因在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV220-OB转化E.coliJM109,经热诱导获得了目的蛋白的表达。经SDS-PAGE鉴定分析,表达产物以包涵体形式存在,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上。通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/mg的高纯度的重组人Leptin。Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异性结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致。纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键。体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性。     

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的Hbmp-2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程Hbmp-2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为102个氨基酸的Hbmp-2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达Hbmp 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :Hbmp 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比Hbmp 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。     

抗PAI抑制作用的纤溶酶原激活剂突变体的活性研究

目的:重组表达抗PAI抑制作用的t-PA突变体,经诱导表达、复性、纯化后进行生物学活性和酶动力学分析。方法:构建pBV220-tpa重组表达质粒,经DNA测序确认后,转化至大肠杆菌DH5a,温控诱导表达,凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化,复性后,过刺桐胰蛋白酶亲和层析柱纯化,酶动力学分析其活性。结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,表达蛋白占总菌体蛋白的30%,经纯化后纯度达90%以上,比活性为7.0×108IU/mg,t-PA突变体与PAI-1反应后,其活性未受到抑制。t-PA突变体酶的米氏常数Km为0.5298,最大水解速度Vmax为0.0595。结论:经生物学活性测定,表达蛋白能够明显抵抗PAI的抑制作用,并具有良好的生物活性,该突变体有可能成为用量更少、疗效更佳的新型溶栓药物。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及活性鉴定

目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,诱导hFLext蛋白表达、纯化及活性鉴定.方法:以人淋巴细胞cDNA文库为模板,克隆hFlext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定.细胞增殖实验检测其生物学活性.结果:成功克隆获得hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21,经1 mM IPTG 30℃诱导12 h,成功表达Trx-hFLext融合蛋白,主要以包涵体形式存在.经8M尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.细胞增殖实验证实其具有生物学活性,能够有效刺激脐血细胞增殖.结论:成功构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hFLext融合蛋白,为造血干/祖细胞的体外扩增研究奠定了基础.     

重组Ⅱ型登革病毒NS1的表达及其免疫原性的研究

目的:表达制备重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1,检测该重组表达蛋白的免疫原性,为检测试剂盒的研制提供基础。方法:根据Ⅱ型登革病毒NS1蛋白基因序列(GenBank登录号:NC_001474),对基因序列进行编码密码子优化后进行全基因合成,随后,经双酶切将目的片段克隆到表达载体pET28a上,通过IPTG诱导表达;表达产物经Western blot鉴定后,进一步进行蛋白纯化和透析复性,制备获得重组Ⅱ型登革病毒NS1蛋白。收获的NS1蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,通过间接酶联免疫学方法测定其效价,检测其免疫原性。结果:成功构建了Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达载体。Western blot显示表达的重组蛋白能够被NS1单抗特异性的结合,纯化复性后的重组蛋白在小鼠体内表现出良好的免疫原性。结论:重组表达的NS1蛋白有良好的免疫原性,为以后的NS1单克隆抗体的制备和登革病毒检测试剂盒的研制提供了良好的基础。     

人骨形成蛋白－2AcDNA基因工程产物诱骨活性的形态学证明

人骨形成蛋白２Ａ（ｈｕｍａｎｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ２Ａ,ｈＢＭＰ２Ａ）ｃＤＮＡ３′端５６７个核苷酸插入表达载体ＰＳＧ４Ｔ－２中,在大肠杆菌中获得１５％的表达,表达产物为２１ＫＤ的蛋白质,经包涵体洗涤,尿素变性和复性后,取１ｉｎｇ表达产物,植入小鼠股四头肌中,２１天后取植入区进行组织切片观察,证实这种基因工程产物具有良好的异位骨诱导活性。     

美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表达

根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从美洲商陆夏季的叶片中克隆美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ,PAP-Ⅱ)基因。将PAP-Ⅱ基因克隆至表达载体pET-28a( )并在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明,PAP-Ⅱ蛋白在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、复性和BBSTNTA树脂柱亲和层析纯化,获得高纯度的PAP-Ⅱ蛋白。用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶有较强的抑制活性,其IC50分别约为303μg/mL,220μg/mL。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物学活性,复性纯化后蛋白对HEP-G2和Hela细胞有细胞毒作用,IC50分别为93μg/mL,102μg/mL,说明了PAP-Ⅱ蛋白能抑制肿瘤细胞的生长。构建的PAP-Ⅱ表达系统所表达的蛋白经复性后具有生物学活性,为进一步研究PAP-Ⅱ的抗HIV-1机制和抗肿瘤作用奠定了基础。     

单纯疱疹病毒1型囊膜糖蛋白gD在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性的鉴定

目的:在大肠杆菌中表达1型单纯疱疹病毒(HSV-1)囊膜糖蛋白gD,纯化重组蛋白并对其免疫活性进行鉴定。方法:将HSV-1 gD 基因克隆入原核表达载体pET-28b,利用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒转化的大肠杆菌,探讨IPTG浓度、诱导时间、诱导温度对重组蛋白表达的影响;盐酸胍裂解变性包涵体,镍柱亲和层析法纯化gD蛋白,并对纯化后的蛋白进行透析复性;Western blot和ELISA检测gD蛋白的免疫活性。结果:酶切和测序结果表明gD基因克隆入pET-28b载体。该重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导后重组蛋白主要以包涵体形式存在,大小约40kDa。gD蛋白诱导表达的最佳条件为0.5mmol/L IPTG于37℃诱导8h。镍柱亲和层析法纯化获得的gD蛋白总量为3.1mg/L,透析复性后获得的gD蛋白总量为1.3mg/L,复性率为41.37%。Western blot及ELISA检测表明表达的gD蛋白具有免疫活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得具有免疫活性的HSV-1 gD蛋白,为进一步制备HSV-1诊断试剂和预防疫苗奠定了基础。     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。     

内毒素结合肽的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

重组人内毒素结合肽 (endotoxinbindingpeptide ,EBP)融合蛋白在大肠杆菌中表达 ,分离和纯化后对其进行生物学活性观察 .将构建好的PinpointⅩa3 EBP生物素融合表达载体转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达菌株 ,亲和层析法纯化表达产物 ,因子Ⅹa(factorⅩa)切割分离内毒素结合肽 ,采用凝胶过滤和反相液相高效色谱法两步纯化 ,从相对分子质量、N端 1 0个氨基酸的序列分析等方面进行鉴定 ;利用人单核细胞U937对重组内毒素结合肽进行了生物学活性的检测 .结果发现 ,内毒素结合肽以包涵体形式存在 ,因子Ⅹa酶切融合蛋白后得到 3 5kD的内毒素结合肽 ,纯化后内毒素结合肽纯度达 99%以上 ,N端 1 0个氨基酸的分析结果与预期相符 ;初步证实内毒素结合肽具有较好的LPS结合活性 ,能够抑制LPS的作用 .经原核表达及纯化复性 ,获得了具有较好生物学活性的内毒素结合肽 ,为进一步研究其功能奠定了良好的基础