原代培养大鼠前列腺细胞建立前列腺增生筛药模型

目的建立原代培养大鼠前列腺上皮细胞体外筛药模型。方法无菌状态下取雄性SD大鼠腹侧叶前列腺,称量后,剪成1 mm3小块,经Ⅱ型胶原酶消化1 h后,过滤、离心获取前列腺细胞,接种于24孔板培养并对细胞进行形态学和免疫组织化学鉴定。获取的大鼠前列腺上皮细胞分别接种于96孔板和24孔板培养12 d后给予系列剂量(0.1～1000μmol/L)的他莫昔芬和阳性药物爱普列特处理72 h,利用CCK-8法检测前列腺上皮细胞存活率并计算药物IC50值,并进一步通过Giemsa染色后观察细胞生长及形态变化。结果细胞鉴定结果显示,获取的细胞具典型上皮细胞形态特征,细胞角蛋白和前列腺特异性抗原表达阳性,提示所获细胞为前列腺上皮细胞。爱普列特与前列腺上皮细胞孵育72 h后,CCK-8法检测结果显示能够明显抑制前列腺上皮细胞生长,其IC50值为42.7μM,进一步镜下观察结果显示,爱普列特未明显改变大鼠前列腺上皮细胞形态,但能导致存活细胞数减少。他莫昔芬则对大鼠前列腺上皮细胞生长无明显抑制作用,镜下观察前列腺上皮细胞数量和形态未见明显改变。结论利用原代培养SD大鼠前列腺上皮细胞可以成功建立前列腺增生体外筛选模型。     

大鼠前列腺上皮细胞角蛋白8mRNA表达调节的定位研究

本文应用反义ＲＮＡ探针原位杂交法，研究雄激素对大鼠腹侧前列腺上皮细胞角蛋白８ ｍＲＮＡ表达的影响，发现１，在任何ＶＰ组织切片中，ＣＫ８探针专一、大量任何ＶＰ组织切片中，ＣＫ８探针专一、大量定位于ＶＰ腺上皮细胞中，ＣＫ８ ｍＲＮＡ是前腺上皮细胞特而灵敏的标志。２。去睾大鼠ＶＰ ＣＫ８ ｍＲＮＡ染色增强，提示ＣＫ ８ｍＲＮＡ有过度表达，注射雄激素又可抑制其过度表达，注射雄激素又可抑制其过度表达。３。与     

奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定

应用组织块培养法高密度培养、连续传代法建立西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养体系,通过生长曲线绘制、核型分析、免疫荧光染色 (角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白)、油红染色及β-酪蛋白基因的RT-PCR分析进行培养细胞鉴定。实验结果表明细胞生长曲线为典型的S型,染色体数目众数为60,细胞角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白表达均呈阳性,油红染色后可见细胞质内的脂滴,且细胞表达酪蛋白mRNA。说明运用本方法培养的细胞为正常的乳腺上皮细胞,并具有一定的泌乳功能。     

成人宫颈上皮细胞的原代培养及鉴定

目的:探索采用无血清培养基原代培养成人宫颈上皮细胞的方法。方法:以成人的宫颈上皮组织为研究对象,采用胰蛋白酶-EDTA消化法获得宫颈上皮细胞悬液,于上皮细胞专用无血清培养基中培养,采用免疫细胞化学法测定细胞中角蛋白及波形蛋白的表达,对细胞纯度进行鉴定。结果:原代培养10-15天细胞融合达60%,传代至4-6代,细胞出现生长衰退。早期细胞生长状态良好,细胞纯度在90%以上。结论:采用酶消化法及K-SFM无血清培养基培养可获得纯度高的成人宫颈上皮细胞。     

猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究

猪是许多呼吸道病毒感染的天然宿主,其与人类在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型以及受体分布都有相似之处。为了解呼吸道病毒感染机制和筛选呼吸系统疾病药物,选择以猪肺组织为原料采用无血清气液界面培养法构建一种猪呼吸道上皮细胞(Porcine airway epithelial cell,PAEC)体外分化模型,然后通过扫描电子显微镜、电生理和免疫组织化学等方法鉴定该模型。采用三质粒共转染法构建重组腺相关病毒rAAV6-GFP(rAAV6-green fluorescent protein,rAAV6-GFP),通过顶端表面感染PAEC模型,探讨AAV6在PAEC模型中基因治疗领域的应用。结果显示分化成熟的PAEC模型为多层上皮结构,顶端表面含有纤毛细胞、黏液分泌细胞和基底细胞。rAAV6-GFP能通过顶端表面感染PAEC,有效地介导外源基因的长期表达。本文建立的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型为呼吸道病原体感染和呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础。     

硬脑膜细胞体外培养模型的建立

目的：建立兔硬脑膜缺损的体外培养模型,观察不同细胞外基质对其愈合过程的影响,研究硬脑膜修复的机制,为以后检测硬脑膜移植物提供理论基础。方法：兔硬脑膜体外培养,再用免疫细胞化学方法和扫描电镜进行观察。结果：预先铺过胶原的培养板中培养8～10d后有细胞从硬脑膜缺损的边缘逸出、增殖,13～15d硬脑膜缺损愈合;而以多聚赖氨酸及层粘连蛋白铺底的培养板中没有看到细胞逸出的现象。硬脑膜细胞对波形蛋白抗体呈强阳性反应,对第Ⅶ因子抗体则为阴性反应;在电镜下可以看到新生胶原的生成。结论：成功建立一种硬脑膜缺损的体外培养模型;成纤维细胞从硬脑膜创缘的逸出、增殖是硬脑膜缺损愈合的重要机制。     

兔羊膜上皮细胞的体外培养和增殖

研究妊娠晚期兔羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells, AECs)在体外生长和增殖特性.取妊娠晚期兔(27-28E) AECs进行体外培养, 光镜、扫描电镜下观察后, 利用免疫组化单克隆抗体AE1/AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白的表达, 并采用流式细胞仪检测表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和血清对AECs细胞周期的影响.结果表明妊娠晚期兔AECs在体外培养条件下生长良好、增殖旺盛; 单克隆抗体AE1/AE3、AE5染色阳性; 血清组、EGF组和联合应用组分别与对照组比较, 各周期细胞比例发生变化, G0/G1期减少, S期、G2/M期增加, 细胞增殖指数(PI)增加, P<0.01, 联合应用组分别与血清组、EGF组比较, P<0.05.说明妊娠晚期兔AECs表达细胞角蛋白CK3, 血清和EGF均能通过改变妊娠晚期兔AECs的细胞周期而促进AECs增殖, 两者联合应用对促进AECs的增殖更为显著.     

甲状腺素T4对体外高温培养奶牛乳腺上皮细胞生长和凋亡的影响

以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,采用台盼蓝染色绘制生长曲线,细胞流式检测细胞凋亡,以正常培养温度(38℃)为对照,研究体外高温培养条件下(42℃),添加不同浓度(0.01、01和1mol/L)甲状腺素(thyroxine,T4)对细胞生长和凋亡的影响.结果表明,不同浓度的T4在38℃有促进奶牛乳腺上皮细胞生长的趋势,但是变化不显著(P>0.05),而T4对缓解高温所造成的乳腺上皮细胞的生长抑制作用也不显著(P>0.05);不同的T4都能够极显著缓解42℃培养1 h和3 h的奶牛乳腺上皮细胞的凋亡(P<0.01),并且对缓解42℃培养3 h的细胞凋亡效果更加明显,但是对42℃培养5 h和8 h的细胞,仅1 μmol/L的T4能够极显著缓解其凋亡(P<0.01).结果提示,T4对高温造成的奶牛乳腺上皮细胞的生长抑制没有明显的缓解作用,但能缓解高温诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡.     

新生大鼠小肠上皮细胞分离培养研究

本实验比较了4种分离大鼠IEC的方法,结果显示联合应用粗胶原酶和中性蛋白酶分离效果最好,细胞贴壁生长能力强。胶原涂膜改善玻璃培养瓶或盖玻片表面的性状有利于细胞贴壁生长。细胞的增殖依赖于培养液的质量、成分及细胞间的相互作用。培养细胞一般1～2天贴壁,7～8天明显增殖,10～14天汇合成片。培养细胞细胞角质蛋白、碱性磷酸酶染色阳性,光镜和电镜检查均显示为IEC。本文所建立的新生大鼠IEC体外培养方法为研究IEC生理和病理提供了一个十分有用的实验模型。     

Differentiation of Rat Lens Epithelial Cells in Tissue Culture

The growth and differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture were studied. Cells could be maintained for a number of generations in an undifferentiated state in suspension culture. When cultured as monolayers, they grew and differentiated in a series of six defined stages described here. These stages include morphological changes (elongation, followed by cell "spreading" or formation of cell aggregates), and biochemical changes (appearance of y-crystallin protein as detected by immunofluorescence). The process of differentiation appeared to be accelerated in the vicinity of elongated cells, occurred more rapidly at high cell density, and required frequent changes of medium. This suggests that cell-cell communication, and not medium factors, may be essential for promoting differentiation. The final morphology of the differentiated cells differed, depending on the embryonic age of the rats used as a source of lens epithelial cells. This implies that the programme for differentiation changes as a function of the embryonic age of the lens.     

鸡输卵管上皮细胞体外分离培养的研究

鸡输卵管上皮细胞是卵清蛋白的主要分泌细胞,是研究输卵管特异表达蛋白调控的重要工具。在以往的研究中,多采用普通DMEM培养液对鸡输卵管上皮细胞进行分离与培养,容易造成其自身特性在体外培养过程中的改变。本研究我们优化了细胞分离方法,发现从输卵管漏斗部组织分离的输卵管上皮细胞增殖较快;用鸡输卵管上皮细胞培养基相比DMEM更适合促进细胞生长;与胰酶相比,用Accutase消化酶进行细胞传代,有利于输卵管上皮细胞特性维持。对所获得的输卵管上皮细胞鉴定发现,己烯雌酚能促进卵清蛋白的表达,说明分离培养的细胞保持了鸡输卵管上皮细胞特性。本研究建立的方法为输卵管特异表达蛋白调控以及家禽生物反应器的研究奠定了基础。     

大鼠薄型子宫内膜模型的建立和鉴定

为探索宫腔注入无水乙醇建立薄型子宫内膜模型的可行性,将25只大鼠分3组:对照组(宫腔注入生理盐水),5分钟组(宫腔注入无水乙醇并贮留5 min),10分钟组(宫腔注入无水乙醇并贮留10 min),经测量子宫内膜变薄者为造模组,5分钟组有14个子宫内膜变薄,10分钟组无一例纳入造模组.免疫组织化学检测角蛋白、波形蛋白、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、雌激素受体α(estrogen related recep-tor alpha,ERα)的表达.结果发现5分钟组造模组与对照组单位内膜面积中角蛋白面积、单位间质面积中波形蛋白面积和子宫内膜中VEGF平均光密度差异有统计学意义(P<0.05),造模组与对照组子宫内膜ERα组织学积分无差异(P>0.05).表明宫腔注入无水乙醇并贮留5 min可以成功建立薄型子宫内膜模型,成功率为70%.     

大鼠主动脉内皮细胞的分离培养和鉴定

目的:探索大鼠主动脉原代内皮细胞体外培养方法,为体外研究提供细胞模型。方法:分离大鼠主动脉,直接贴壁于培养皿中,荧光倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色鉴定细胞。结果:约24小时组织块边缘有游离的新生细胞长出,7天即融合成片。消化传代后细胞呈短梭形或三角形,单层生长,铺路石状,Ⅷ因子表达阳性,呈指数增殖。冻存后复苏细胞活性均超过90%。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。     

用BRL-3A条件培养基培养鸡胚胎干细胞的初步研究

以CEF细胞、MEF细胞和STO细胞为饲养层,用:BRL-3A条件培养基培养寿光鸡X期胚盘细胞,并对获得的细胞克隆进行了鉴定,证明其具有ES细胞的克隆形态、PAS染色阳性、AKP染色阳性、能分化为多种类型的细胞、能参与受体胚胎的发育并形成羽色嵌合体.实验结果表明:BRL-3A条件培养基能促进鸡ES细胞克隆的形成,用饲养层比不用饲养层更有利于克隆的形成,且STO细胞和MEF细胞饲养层的培养效果要好于CEF细胞饲养层(P<0.05);挑克隆传代法比全消化法更有利于克隆的形成和未分化状态的维持(JP<0.05).     

亚硒酸钠诱发的晶状体上皮细胞DNA损伤及修复

观察了亚硒酸钠（Ｎａ２ＳｅＯ３）在体外作用于大鼠晶状体上皮细胞（ＲＬＥｃｅｌｌｓ）而造成的ＤＮＡ单链断裂（ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ,ＳＳＢ）,并对其ＤＮＡ损伤、修复动力学做了初步研究．发现ＳＳＢ严重程度与亚硒酸钠的浓度呈线性相关,其ＳＳＢ重接修复约在３０～６０ｍｉｎ内完成．还作了有关非程序ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）的检测,发现与ＳＳＢ相比,ＵＤＳ发生迟且持续时间更长,提示Ｎａ２ＳｅＯ３可能在体外对大鼠晶状体上皮细胞除造成ＳＳＢ以外,还可能造成其它种类的ＤＮＡ损伤．     

Cell Lineage Identification and Stem Cell Culture in a Porcine Model for the Study of Intestinal Epithelial Regeneration

Significant advances in intestinal stem cell biology have been made in murine models; however, anatomical and physiological differences between mice and humans limit mice as a translational model for stem cell based research. The pig has been an effective translational model, and represents a candidate species to study intestinal epithelial stem cell (IESC) driven regeneration. The lack of validated reagents and epithelial culture methods is an obstacle to investigating IESC driven regeneration in a pig model. In this study, antibodies against Epithelial Adhesion Molecule 1 (EpCAM) and Villin marked cells of epithelial origin. Antibodies against Proliferative Cell Nuclear Antigen (PCNA), Minichromosome Maintenance Complex 2 (MCM2), Bromodeoxyuridine (BrdU) and phosphorylated Histone H3 (pH3) distinguished proliferating cells at various stages of the cell cycle. SOX9, localized to the stem/progenitor cells zone, while HOPX was restricted to the +4/‘reserve’ stem cell zone. Immunostaining also identified major differentiated lineages. Goblet cells were identified by Mucin 2 (MUC2); enteroendocrine cells by Chromogranin A (CGA), Gastrin and Somatostatin; and absorptive enterocytes by carbonic anhydrase II (CAII) and sucrase isomaltase (SIM). Transmission electron microscopy demonstrated morphologic and sub-cellular characteristics of stem cell and differentiated intestinal epithelial cell types. Quantitative PCR gene expression analysis enabled identification of stem/progenitor cells, post mitotic cell lineages, and important growth and differentiation pathways. Additionally, a method for long-term culture of porcine crypts was developed. Biomarker characterization and development of IESC culture in the porcine model represents a foundation for translational studies of IESC-driven regeneration of the intestinal epithelium in physiology and disease.