肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统及其转位效应器蛋白质

肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)0157:H7是一种重要的肠道病原微生物,感染后可引发多种疾病,严重者可导致死亡.EHEC O157:H7通过Ⅲ型分泌系统(TTSS)将其转位效应器蛋白质转位至宿主细胞,经一系列的信号传导过程介导与宿主细胞的"黏附与擦拭"(attaching and effacing,A/E)损伤.对EHEC0157:H7 Ⅲ型分泌系统及其转位效应器蛋白质进行研究,可使我们进一步认识EHEC以及引起A/E损伤的病原菌的致病机理,丰富有关Ⅲ型分泌系统和致病岛的知识.     

肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。     

大肠杆菌O157:H7 sRNA基因E40缺失突变株的构建

目的:利用Red系统构建肠出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40缺失突变株。方法:选取本实验室预测并经过实验验证的sRNA基因,根据NCBI上相应的序列,设计2对引物分别扩增该sRNA基因的上下游分别长464和455bp的同源臂,经PCR扩增,构建到相应的载体,最后以构建好的含上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的长约2500bp的线性片段作为打靶片段,在Red重组系统的作用下与sRNA基因E40的上下游同源区域发生同组,从而把sRNA基因从基因组上置换下来,之后利用质粒pCP20将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除。结果与结论:构建了出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40的缺失突变株,为进一步研究sRNA基因在出血性大肠杆菌O157:H7生长及致病过程中所起的功能奠定了良好的基础。     

肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统效应因子与宿主细胞相互作用研究进展

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)通过其Ⅲ型分泌系统将效应因子注入到宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路从而有利于细菌的感染及定植。近年来对于EHEC Ⅲ型分泌系统效应因子与宿主细胞相互作用研究成为EHEC致病机制研究新的热点,研究表明,除了经典的效应因子外,一些新发现的效应因子在细菌的致病过程中也发挥着重要作用,有些效应因子能够抑制宿主细胞内正常的信号通路,有些效应因子还具有抑制细胞凋亡,干扰炎症信号通路和抑制吞噬的作用。这些发现揭示了EHEC效应因子具有多种功能,它们通过与宿主细胞间的相互作用,在细菌的感染过程中发挥着重要作用。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 TCCP蛋白研究进展

TCCP(內膜素受体偶联细胞骨架蛋白,Tir couple cytoskeleton protein)是近年研究新发现的EHEC(肠出血性大肠杆菌)O157∶H7致病分子,它经大肠杆菌Ⅲ型分泌系统转导入宿主细胞内,结合并活化宿主蛋白N-WASP(神经威奥综合症蛋白),引起肌动蛋白的聚集,最终诱导特征病理改变黏附、擦拭(A/E)损伤的形成。本文就近年来对它的研究情况作一简要综述。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7监测及分析

为了了解长春地区动物和人感染肠出血性大肠杆菌O157H7状况,建立流行病学监测网.采集长春市动物养殖场动物粪便和腹泻病人便样进行监测.结果在牛粪和鸡粪中共检出2株O157H7大肠杆菌.可见,在长春地区存在肠出血性大肠杆菌O157H7菌潜在污染的威胁,需要加强监测力度.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素与受体的研究进展

肠出血性大肠杆菌O157∶H7能引起出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血小板减少性紫癜等。大肠杆菌O157∶H7的主要毒力因子紧密黏附素由其毒力岛LEE岛上的eae基因编码,C末端的280个氨基酸是受体结合位点。目前发现紧密黏附素受体有紧密黏附素转位受体(Tir)、核仁素和β1整合素。紧密黏附素主要与受体Tir结合,通过Ⅲ型分泌系统转位到宿主细胞,在Tir-细胞骨架偶联蛋白(Tccp)的参与下,与N-Wiskott aldrich综合征蛋白、肌动蛋白-相关蛋白2/3相互作用产生信号级联放大,导致宿主大肠黏膜上产生黏附-抹去损伤。     

用含10%胎牛血清的DMEM培养肠出血性大肠杆菌O157∶H7可增强其对HeLa细胞的黏附/擦拭损伤

目的:研究生长在不同培养基中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7对宿主细胞造成的黏附/擦拭损伤是否存在差异。方法:分别用LB、DMEM、DMEM(含10%胎牛血清)、DMEM(含终浓度为25mmol/L的HEPES)等4种培养基培养O157∶H7,然后感染HeLa细胞,利用Giemsa染色观察细菌黏附差异,进行肌动蛋白荧光染色实验并观察宿主细胞肌动蛋白聚集差异。结果:在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养EHECO157∶H7,其黏附力增加,聚集细胞骨架肌动蛋白的能力明显增强。结论:为进一步研究EHECO157∶H7的致病性,探索O157∶H7新的致病因子奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7感染流行概况

大肠杆菌O157∶H7是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型,可引起腹泻、出血性肠炎,极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症,死亡率高。1982年被发现以来,大肠杆菌O157∶H7已在世界多个国家引起过爆发流行,呈现了流行的世界性,中国也于上世纪90年代末在局部地区出现了爆发,死亡率极高,引起了相关部门的高度重视。本综述试图通过对大肠杆菌O157∶H7在世界范围流行状况的描述,提高公众对该病的认识,为相关疫苗的研发提供流行病学资料。     

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157∶H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157∶H7核酸的荧光定量PCR检测方法.实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108 cfu/mL.稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06％和2.45％.     

大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2毒力岛研究进展

许多革兰氏阴性菌借助Ⅲ型分泌系统黏附在宿主细胞表面,然后跨越胞膜将特异性蛋白注入宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路,从而有利于细菌的感染及定殖。在肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)中,除了肠细胞脱落位点(Locus of entericyte effacement,LEE)毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)外,在分析肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组序列时发现一个新的Ⅲ型分泌系统,大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(Escherichia coli type Ⅲ secretion system 2,ETT2)毒力岛。研究显示,ETT2可能在大多数菌株中不具有完整的分泌系统功能,但是其对于细菌毒力的发挥具有重要作用。因此,本文简要综述了大肠杆菌ETT2的基因特征、ETT2的分布与流行、ETT2的功能与机制等方面的主要研究进展。     

利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌GroEL蛋白复合物

肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的致病菌,加深其致病机理的基础研究将为相关疫苗研究及疾病控制等提供新的思路和依据.串联亲和纯化(TAP)技术是最近发展的分离纯化天然状态蛋白质复合物进而研究蛋白质相互作用的新方法.用我们自己构建的原核表达串联亲和标签载体,在大肠杆菌O157∶H7中表达了标签融合蛋白GroEL-TAP,建立了非变性条件下制备蛋白复合物的方法,并且对串联亲和纯化过程中的相关实验条件进行了探索和优化,最终得到了高纯度的GroEL-TAP与天然GroEL形成的嵌合型多聚体复合物.这表明我们建立的串联亲和纯化技术能高度特异地纯化靶蛋白参与形成的复合物,为后续寻找O157∶H7中毒力蛋白参与形成的复合物奠定了实验基础.     

基于信息离散性度量方法的大肠杆菌全基因组比较研究

应用方伟武教授提出的一种新的信息离散性度量方法---FDOD(functionofdegreeofdisagreement)方法对致病性大肠杆菌O157∶H7和非致病性大肠杆菌K12的全基因组序列进行了比较,分析了二者的相似序列部分,及差异较大的序列部分,证实了大肠杆菌O157∶H7核酸序列注释中可能致病的特有序列与正常序列的不同。     

Tir细胞骨架偶联蛋白:大肠杆菌O157：H7的一种新的毒力因子

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的传染性病原菌,可引起多种致死性疾病的爆发流行。Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)是近年来发现的O157:H7的一种新的重要的毒力因子,在O157:H7黏附宿主细胞造成黏附擦拭(A/E)损伤过程中起重要作用,TccP相关研究对阐明O157:H7致病机制具有重要意义。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H786-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株(缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp),并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H7 86-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株（缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp）,并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7 ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA和EspB蛋白的重组表达及其免疫效果

目的：通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的EspA和EspB蛋白,并分析它们的免疫保护性。方法：采用PCR技术从EHEC0157：H7基因组中扩增espA和espB基因,连接至pET-22b（4-）载体上,转化至宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,免疫小鼠分析其免疫保护性。结果：重组espA和espB基因片段的测序结果与GenBank中的相应基因序列完全一致,一致性均为100％;得到了纯度为95％以上的重组EspA和EspB蛋白,免疫小鼠所得到的抗体效价均为10^6。结论：重组EspA和EspB蛋白获得了可溶性表达,表达的蛋白具有良好的免疫保护性,为进一步制备疫苗奠定了基础。     

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR 反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法.以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性.沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml.在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性.研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测.     

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157:H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157:H7核酸的荧光定量PCR检测方法。实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108cfu/mL。稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06%和2.45%。     

大肠杆菌astE、rph基因敲除突变株的构建

目的:分别构建大肠杆菌astE、rph基因敲除突变株,并检测其异丁醇耐受性的变化。方法:利用Red重组系统分别敲除大肠杆菌的astE和rph基因,并对所获得的突变株进行异丁醇耐受性相关实验研究。结果:成功构建了astE基因缺失突变株△astE和rph基因缺失突变株Δrph,发现两种突变株的异丁醇耐受性均有所提高。结论:通过缺陷菌株的构建,为未来进一步代谢改造生产异丁醇和研究异丁醇耐受机制奠定了基础。