卡介苗菌株的变化

<正>前言 BCG来源于Nocard从一头患结核性乳腺炎的奶牛分离到的结核杆菌毒性牛型株。在减毒过程中Calmctte(卡氏)和Guerin(介氏)在1908年注意到一个偶然的发现,经培养的结核杆菌粘聚团块中加入牛胆汁很容易地能使粘聚菌块分散。于是,他们发明了一种含甘油的胆汁马铃薯培养基,并且他     

p300乙酰化在卡介苗感染中的作用

研究p300乙酰化在卡介苗(bacillus Calmette Guérin,BCG)感染中的作用。构建THP-1巨噬细胞模型,比较BCG感染前后p300蛋白表达水平和组蛋白H3乙酰化水平的改变,加入p300特异性抑制剂Delphinidin,观察细胞内组蛋白H3乙酰化水平的变化。结果表明,在分化成熟的THP-1细胞系中,BCG感染能够上调p300蛋白表达水平和组蛋白H3乙酰化水平,加入p300特异性抑制剂Delphinidin后,组蛋白H3乙酰化水平降低。BCG感染通过p300途径导致蛋白质乙酰化水平发生改变。     

sigH-rshA过表达对卡介苗菌株致病性的影响

卡介苗(Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin, BCG)是目前唯一许可的结核病预防用疫苗,但菌株间基因组水平的改变导致疫苗在保护效果、安全性等方面存在诸多差异。【目的】验证DU2Ⅲ和Ⅳ遗传型中sigH-rshA过表达与BCG菌株毒力变化的相关性。【方法】利用分子克隆技术构建了过表达sigH-rshA的重组BCG China和BCG Japan菌株,通过RT-PCR和Western blotting验证基因表达。利用巨噬细胞和重症联合免疫缺陷(server combined immune-deficiency,SCID)小鼠感染模型评价重组BCG的毒力变化;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试验评估肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)分泌。【结果】SigH-RshA蛋白过表达能够显著促进BCG的胞内增殖,同时刺激巨噬细胞产生更高水平的TNF-α分泌;SCID小鼠试验结果显示sigH-rshA过表达能提高重组BCG对免疫缺陷小鼠的毒力。...     

多重PCR方法特异性鉴定卡介苗菌株多糖核酸的初探

与结核分枝杆菌H37Rv菌株进行比较,BCG菌株可找到一个特殊的缺失片段RD1,它存在于所有有毒分枝杆菌中,而在所有的卡介苗菌株中均缺失。应用多重PCR方法检测RD1区的存在与否,可以区别BCG和其它有毒的分枝杆菌。卡介菌多糖核酸来源于卡介菌,检测成品中DNA是否含有RD1区,能特异性地鉴别该制品。结果显示牛分枝杆菌标准株和结核分枝杆菌H37Rv存在RD1区;而卡介菌多糖核酸注射液和国内皮内注射用BCG疫苗生产用菌株扩增产物一致,提示均缺失RD1区。因此,这种多重PCR方法适用于卡介菌多糖核酸注射液的特异性鉴别试验。     

分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknK的功能研究

【目的】丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶K(Serine/Threonine protein kinases K)是分枝杆菌类似真核样的蛋白激酶,预测在分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程中起着重要的作用,解析PknK的生物功能及作用机制,将为结核病的防治提供一定的理论基础。【方法】通过基因敲除等遗传方法获得结核分枝杆菌疫苗株BCG的pknK敲除菌株△pknK、回补菌株pMV361-pknK/△pknK和过表达菌株pMV261-pknK/BCG;对获得的菌株进行生长曲线测定和抗药性分析;通过pulldown-MS方法及生物信息学方法鉴定了PknK相互作用蛋白。【结果】监测各种分枝杆菌△pknK、pMV361-pknK/△pknK和pMV261-pknK/BCG生长,确定PknK负调控BCG生长;抗药性分析显示PknK降低BCG的耐药性;pulldown-MS方法显示PknK与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA和双组分系统中的反应调节因子MtrA、TrcR、MoxR等蛋白相互作用。【结论】研究发现PknK调控分枝杆菌的生长和耐药性,我们的研究为深入研究PknK在结核分枝杆菌中的功能奠定了基础。     

卡介苗的黏膜免疫途径

卡介苗(BCG)是目前预防结核病的唯一疫苗,为牛分枝杆菌减毒株,自发现以来接种达30亿剂,是应用最广泛的疫苗.尽管BCG应用了80多年,但其保护效果存在争议,从0至80%不等,原因有BCG有效抗原的丢失、环境分枝杆菌的干扰等.此外接种剂量、菌株及接种途径的影响也在受到关注.世界卫生组织(WHO)推荐使用皮内接种BCG.     

卡介苗对癌症和白血病的应用(续二)

<正> 六、BCG来源 几篇报导叙述某些BCG亚林对肿瘤比另一些菌株更有效。Mathe实验室报导了世界范围BCG菌株的比较(法国,英国、芝加哥、巴西、马德拉斯、日本、丹麦)。试验包括溶血斑形成的T和B淋巴细胞试验,T淋巴细胞的移植物抗宿主反应(GVHR)和小鼠对三种鼠肿瘤的免疫予防法。他们指出新鲜法国株在全部试验中都有效,而冻干伪所有菌株,包括法国菌株只对某些实验模型有效。然而,活菌数没进行比较,因而结果不能肯定。比较了Pasteur Phipps,Ticer Rostnthal和Glaxo亚株对豚鼠肝癌的作用,这些菌苗是分散生长并冻干制造的(活菌数相同)头3个菌株具有相等的肿瘤抑制特性而Glgxo亚株的肿瘤抑制作用差。液体-冻干Phipps与Glaxo。冻干菌苗相比较在大田鼠移植 SV 40肿瘤系统中使用BCC与照射肿瘤细胞联合使用,结果Glaxo菌株比Phipps亚株对肿瘤的抑制能力差的     

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100的构建及应用

利用分子生物学方法,构建了大肠杆菌分枝杆菌(E.coliMycobacterium)穿梭表达质粒pBCG-2100,研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽S转移酶(Glutathione Stransferase,GST)抗原基因在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)中的表达。以含人结核杆菌热休克蛋白(Heat shock protein,hsp)70基因全长序列的质粒pMT-70为模板,扩增出hsp70启动子,测序选出无错配的启动子,将其定向克隆入E.coliMycobacterium穿梭质粒pBCG-2000中,构建成E.coliMycobacterium穿梭表达质粒pBCG-2100。再将编码GST的cDNA按正确的阅读框顺序,克隆到pBCG-2100中hsp70启动子的下游,得到分枝杆菌表达质粒pBCG-GST。将pBCG-GST电转化入BCG中,筛选出重组BCG疫苗,经热诱导后所表达的重组GST(rGST)抗原,为可溶性蛋白,经纯化后,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带,其表达量占BCG菌体总蛋白的13%。Western blot提示rGST能与抗GST的抗体反应。     

Bacillus Calmette(BC)研究所预计2001年春申请生产杀虫病毒制剂

《日经生物技》术2000年3月27日号第14页报道：Bacillus Calmette(BC)技术开发研究所最近宣布,预计在2001年春提交利用昆虫病毒生产生物农药的申请。 据说如农药审查顺利,打算于2002年商品化。如果能商品化,将成为国内第1号利用病毒生产的生物农药。虽然该生物农药在海外已实用化,但是在日本国内还没有商品化。 Bacillus Calmette(BC)技术开发研究所正在开发中的天敌病毒制剂是以茶叶害虫一茶蛾、茶卷叶蛾为对象的两种杀虫性病毒(茶蛾粒病病毒、茶卷叶蛾粒病病毒)的混合剂。现正由日本植物防疫协会进行其杀虫效果的评价试验。 Bacillus Calmette(BC)技术开发研究所是生物系特定产业技术研究推进机构(生研机构)98年度投资资助,于1999年2月正式设立。除生研机构外,日本化药等3个公司也投入了资金。Bacillus Calmette(BC)技术开发研究所的试验研究期限为6年,研究经费总额为5亿日元。孙国凤     

核酸、核酸前体对结核分枝杆菌H37Ra和BCG生长的影响

在罗氏培基中添加嘧啶类化合物或其组合物,对结核分枝杆菌H37Ra和BCG菌株有明显的生长促进作用。这种生长促进作用在不利于生长的PH条件下更加明显。 种子斜面在4℃冰箱贮存的时间越久,嘧啶类化合物的生长促进作用越明显。鸟嘌呤和鸟嘌呤核苷酸对结核分枝杆菌的早期生长有促进作用。在罗氏培基中添加0．3—5mg/L的RNA或DNA,对菌株H37Ra和BCG的生长无刺激作用。     

疫苗

924009异源基因在牛分枝杆菌BCG中的表达:抗HIV一1Nef蛋白细饱反应的诱导〔英〕/Winter,N.…了Geue一1991,109(i)一47~54〔译自DBA,1992,11(8),92一04359〕 为了用牛分枝杆菌菌株BCG作保护性抗原载体,将编码Nef蛋白的H工V一病毒一1基因克隆于大肠杆菌一分枝杆菌穿梭载体(质粒pRR3)几中并导人BCG。质粒pRR3含一个在分枝杆菌中复制和保留必需的质粒pALSOo。片段、转座子Tn 903卡那霉素抗性基因和大肠杆菌复制原。n“f_基因在含白色链霉菌(St,epto哪歹ees albos)groES/groELi操纵子的启动子和合成核糖体结合位点的DNA表达框架(…     

卡介苗对枯否细胞生物特性影响的免疫细胞化学研究

卡介苗(BCG)是增强肝枯否细胞(KC)抗肝癌细胞作用的最佳免疫制剂之一。本实验是给大鼠BCG后,应用溶菌酶免疫细胞化学法显示KC,以图象分析系统测定KC的数量、分布和面积,以细胞分光光度计测定KC溶菌酶活性;分离KC体外受BCG作用后,用ELISA法测定RC的Fc受体表达。结果显示:BCG使KC数量增多一倍,尤以肝小叶周边带为显著;KC体积明显增大,细胞面积增大55.71％,周边带KC面积增大一倍上;细胞溶菌酶光密度增大64.35％;Fc受体表达增强64.82％。上述结果是BCG增强KC抗肝癌细胞作用有关细胞学机制。     

豚鼠膀胱灌注卡介苗后的毒性研究

为观察治疗用BCG对豚鼠膀胱所产生的毒性反应和中毒程度 ,确定中毒靶向器官 ,以BCG12mg/kg .3d和36 0mg/kg .3d两个剂量对雌性豚鼠进行膀胱灌注 ,连续 3个月 ,共计 2 8次。结果显示BCG可明显引起豚鼠膀胱炎症反应 ,血中性粒细胞含量增多和尿素氮值升高。所有异常指标在用药后 1个月内基本恢复正常 ,提示治疗用BCG是一种安全、低毒的生物制品 ,为临床安全用药提供了依据     

卡介苗标准化

<正> 当前,普通认为世界各地用于制备卡介苗的 BCG亚株的特性是不同的。国际和各国的研究机构在不断努力制定用于实验室和临床上评价卡介苗的一些标准。多年来为了制定出一些评价BCG效力的可接受标准,WHO,IUAT及国际儿童中心召开专家会议,举行讨论会,建立了研究小组。HEW生物学标准化常设分部已作出有关BCG标准化的最低要求,但是到目前为止并没有一个对所有菌苗进行测定的普通一致的有效方法。例如,哥本哈根WHO结核研究机构组织协作。于1959年在七个国家的八个实验室进行了测定BCG不同方法的研究,每个实验室都得到同样的四种菌苗,其中七个实验室用正规检定法做了活菌计数,一个实验室用自己的mg/ml法作细菌总数测定。同一批菌     

BCG—PPD的制备及应用

用三氯醋酸(TCA)和硫酸铵(AS)综合法,由卡介菌苗(BCG)培养滤液中提纯制得卡介菌素纯蛋白衍生物(BCG—PPD)。BCG—PPD的纯度和结核菌素纯蛋白衍生物国际标准(PPD-S)及中国标准(PPD—C)相近,高于加拿大标准(PPD—CT68)和丹麦标准(PPD—RT23)。在BCG免疫豚鼠中,BCG—PPD的皮肤迟发型变态反应(DTH)大于结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)的DTH反应。在结核菌感染豚鼠组中,BCG—PPD的DTH反应小于PPD的DTH反应.在检查333名新生儿接种BCG12周后的免疫     

结核分枝杆菌体外休眠模型的建立

目的:模拟结核分枝杆菌体内缺氧和微营养的生长环境建立其休眠模型。方法:将牛分枝杆菌卡介苗野生株BCG菌株在"微需氧+pH5.0+10%Dubos"的条件下培养,以菌株生长停滞,菌体表面脂质体增厚为休眠标准进行鉴定。取不同时间菌株测定600 nm下的吸光度(A)值绘制生长曲线,同时进行金胺O-尼罗红(Auramin-O,Nile Red)双荧光染色和实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime-PCR,qRT-PCR)检测休眠相关基因的表达量,确定菌株进入休眠状态。结果:在休眠条件培养过程中,BCG菌株的生长速度与常规条件培养菌株相比明显减慢(P0.01),并且在休眠条件培养中第10、14和18天细菌生长基本接近停滞状态(P0.01);同时金胺O荧光染色显示绿色荧光减弱,尼罗红红色荧光增强;休眠相关基因hspX、devR表达量逐渐上调,且培养第18天菌株明显高于第0天培养菌株(P0.05)。结论:应用"微需氧+p H5.0+10%Dubos"条件培养,以金胺O-尼罗红染色和devR表达为标准,可以成功建立结核分枝杆菌休眠模型。     

BCG对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的从细胞增殖和凋亡两方面观察BCG对乳腺癌细胞MDA—MB-231的抑制作用。方法用MTT法检测BCG作用后MDA—MB-231细胞的增殖能力,采用TUNEL法检测凋亡。结果BCG能明显降低MDA-MB-231细胞的增殖代谢活性而抑制其增殖。TUNEL法染色显示BCG可显著增加凋亡细胞。结论BCG不仅能显著抑制MDA—MB-231细胞增殖,还能有效诱导其凋亡。     

抗生素联合卡介苗治疗结核病的动物模型评价

目的用豚鼠模型初步评价抗生素联合卡介苗治疗结核病的可行性。方法用高剂量Mtb皮下攻击豚鼠2周后,将重组ESAT6-CFP10(EC)变态反应原皮试阳性的豚鼠随机分成4组:NS组、BCG组、抗生素组、抗生素+BCG组。抗生素+BCG组接受异烟肼(isoniazid,INH)和利福喷丁(rifapentine,RFT)的联合化疗,1次/周,共3次,给药结束后,每只豚鼠皮下免疫1/10人用剂量BCG;BCG组每只豚鼠仅皮下免疫1/10人用剂量BCG;抗生素组仅给药INH和RFT,1次/周,共3次;NS组给予生理盐水作为阴性对照。全部豚鼠于攻毒13周后安乐死解剖,评价肝、脾、肺的脏器综合病变指数,计算脾脏活菌载量(lg CFU),并对肝、脾、肺脏器做组织病理检查。结果 NS组、BCG组、抗生素组和抗生素+BCG组的脏器评分分别为83±8、81±10、45±28和33±14。其中,BCG组与NS组差异无统计学意义;抗生素组和抗生素+BCG组与NS组差异均有统计学意义(分别q=6.84,P0.001;q=9.02,P0.001),两组与BCG组比较,差异也均有统计学意义(q=6.44,P0.001;q=8.63,P0.001);但抗生素组与抗生素+BCG组差异无统计学意义。抗生素+BCG组豚鼠的脾脏活菌载量为(3.62±1.13)lg CFU,与NS组的(4.92±0.52)lg CFU和BCG组的(5.20±0.43)lg CFU比较,差异均有统计学意义(q=5.54,P0.01;q=6.72,P0.001)。抗生素组脾脏活菌载量为(4.39±0.50)lg CFU,与其他各组的差异均无统计学意义。病理组织切片显示各组病变程度由重到轻依次为BCG组NS组抗生素+BCG组≈抗生素组。结论化疗后免疫1针BCG的治疗效果较差,多针次的BCG免疫效果还需进一步研究。     

敲除pckA基因的结核杆菌引起的免疫反应的研究

研究结核杆菌pckA基因编码的磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)诱导机体产生的保护性免疫反应。用敲除pckA基因的牛结核杆菌BCG和野生型BCG分别感染小鼠,取肝、肺、脾进行病理分析,并进行脾细胞培养,检测CD4 、CD4 /CD8 、细胞因子IFNI-γI、L-12和TNF等。用敲除pckA基因的BCG感染的小鼠比野生型BCG感染的小鼠体内产生的结核结节少且不典型,炎性程度低。野生型BCG感染的小鼠脾脏内的CD4 T细胞和CD4 /CD8 、细胞因子IFN-γ、IL-12、TNF均明显高于敲除pckA基因BCG感染的小鼠。pckA基因为结核杆菌生长所必需,其编码产物PEPCK能够刺激机体产生免疫反应,是一种很好的疫苗候选分子。     

结核杆菌蛋白质组学研究进展

结核病是对人类威胁最大的传染病之一,尽管牛型结核分枝杆菌疫苗（BCG）和各种抗结核药物在全球范围内得到了广泛应用,但近年来,随着人口流动及密度的增高,结核杆菌多重耐药菌株及同人体免疫缺陷病毒（HIV）双重感染的出现,结核病已在发达国家和发展中国家呈再度肆虐态势。