脂质体介导转染法的原理与应用

脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层 ,又称为人工生物膜。最初 ,人们只是运用脂质体模拟生物膜 ,研究膜的构造及功能 ,从而发现了膜的融合及内吞作用 ,因而可用作外源物质进入细胞的载体。相对于电穿孔法和磷酸钙共沉淀转染法 ,脂质体介导转染法简便易行 ,成本适中 ,具有较高的转染率和较小的细胞毒性。1 .脂质体的组成和制备1 .1　组成脂质体的脂类　　现有的商业化脂质体均为阳离子脂类与中性脂类的复合体 ,如ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ等 ,中性脂类多为二油酰磷脂酰乙醇胺 (ＤＯＰＥ)。其中 ,阳离子脂类…     

脂质体作为基因工程载体的研究

脂质体是由天然脂类和(或)类固醇组成的微球体,核酸分子可被包裹在微球体内部空间,通过细胞内吞作用(endocytosis)及膜融合(membrane fusion)进入细胞。由于脂质体没有毒性,制备容易,因此,脂质体作为基因载体越来越受到重视。     

包含RNA的复层与单层脂质体的制备、生物学特征及其RNA对癌细胞的参入

本文报导了制备包含RNA的单层脂质体(Unilamellar Liposome又名脂质小泡Vesicle)和复层脂质体(Muhilamellar Liposome,或简称脂质体Liposome)的两种新方法。一是在高压下(200公斤/厘米~2)将脂类通过0.9毫米的微孔喷入RNA水溶液;另一是通过浮力将脂类均匀地慢速(每分钟15～25微升)注入RNA溶液。经过超离心和DEAE-Sephadex A_(50)柱层析可分离和纯化单层和复层脂质体。经电镜鉴定,所得样品是典型的脂质体。单层脂质体直径在500 A以下。复层脂质体呈不均一颗粒,最大者为1微米。电镜和同位素参入均证明上述两种脂质体包裹了RNA。我们还制备了博莱霉素A_5琥珀酰硬脂酰胺的钴螫合物(Co-BLS)以参入脂类,并试图作为脂质体的“导向”装置。我们又制备了各种类型包裹~(125)Ⅰ-RNA的脂质体。经核糖核酸酶(RNase)温浴,证明脂质体可保护所包裹的~(125)Ⅰ-RNA免受RNase的降解。同时证明脂质体腹腔内注射后可促进所包的~(125)Ⅰ-RNA参入小鼠腹水型肝癌细胞,而且含Co-BLS的脂质体促进作用更为明显。通过带瘤小鼠静脉内注射,脂质体所包含的RNA可参入皮下型移植性肝癌细胞,但参入比例不如腹腔注射明显,然而肝脾内比放射性百分比并不高,与文献报导不同。上述实验结果提示了以脂质体包裹核酸或其他药物,应用于遗传工程、遗传操纵或肿瘤化疗的可能性。     

脂质体通透性的微型计算机测定

十多年来,人们对生物膜的结构,特别是动态结构,已有了相当多的了解,这是和对脂质体的研究分不开的。在研究膜的相变、流动性、膜上脂质和蛋白质的相互作用、金属离子等对膜的作用以及膜的重建等方面,都要用脂质体作为模型。近几年,脂质体又被作为“技术工具”受到多方面重视,尤其是作为药物、酶及遗传物质等的载体已形成一种新型的“给药系统”,步入了生物技术的领域。在这些研究中,脂质体的通透性是个很重要的参数,它和膜的结构密切相关,同时影响着膜的许多功能。     

胆固醇对脂双层结构影响的SAXS和STM研究

用小角X射线散射（SAXS)和扫描隧道显微镜（STM）技术分别研究了模拟生物膜脂质体的结构以及胆固醇对生物膜双层结构的影响。结果表明,在扫描隧道显微镜照片中,磷脂分子在石墨表面形成规则的二维点状排列图像;磷脂胆固醇脂质体在石墨表面形成规则的二维波纹状排列图像。用小角X射线散射研究结果表明,DPPC脂质体是片层相结构,DPPC＋Chol脂质体是复相片层结构,DPPE＋Chol脂质体是片层立方相结构,DPPC＋DPPE＋Chol脂质体是立方六角形相结构。     

引人注目的脂质体

说起导弹,人们便会想到它具有专一地追踪,摧毁目标的功能。经过多年的艰苦探索,一种新型的超微型生物导弹,已经研制问世。这种生物导弹就是脂质体(liposome)。脂质体是由磷脂双分子层人工膜在水溶液中形成的微囊。双分子层是生物膜结构的重要组成部分,而制备脂质体采用的磷脂和胆固醇均是天然存在的物质,所以脂质体膜近似天然的生物膜。脂质体具有亲水性,又具有亲脂     

人脂素基因LIPIN1在酵母中的异源表达及细胞功能分析

脂类代谢调控是维持生物体能量平衡的重要环节,脂类代谢调控的紊乱与肥胖症、糖尿病和高血压等疾病密切相关。脂素基因三LIPIN1是诱导脂肪细胞分化、调控脂类合成的关键基因．其编码的磷脂磷酸酶（phosphatidate phosphatase,PAP）在人体三酰甘油合成中起关键作用,是维持人体脂类平衡的重要保障。此外,该基因还作为重要的转录辅激活因子参与多种生长及营养代谢调控。多种生物中均有类似功能的基因被发现,暗示了其功能的多样性及物种间的保守性。该文利用酿酒酵母在脂类代谢研究中性状易于表征、同源基因剧刖功能明确的优势,通过同源重组技术构建脂素缺陷型酵母,探索脂素基因在维持酵母正常生长及脂类合成中的重要作用,并通过功能互补及生物信息学技术对比分析了人源LIPIN1基因与酵母PdH1基因编码蛋白在结构和功能上的保守性,为脂素基因LIPIN1的细胞功能研究提供基础数据。     

水稻与拟南芥跨膜蛋白14家族的分子进化特征与功能分析

脂类既是植物生命活动重要的能量来源,也是细胞膜系统不可或缺的结构成分,在植物生长发育和逆境反应等生命活动过程中都起到至关重要的作用。随着脂类代谢研究的不断深入,植物脂类合成通路已渐渐明晰,其中连通不同细胞器间脂类合成中间物质运送的膜蛋白也正被不断发现,但对质体脂类转运蛋白还鲜有报道。跨膜蛋白14家族(Transmembrane 14 family, Tmemb14 family)是一个新发现的跨膜蛋白家族,目前只有拟南芥FAX1 (Fatty Acid Export 1)和斑马鱼TMEM14已被克隆鉴定,该家族其他成员的生物学功能还未见报道。AtFAX1参与植物质体长链脂肪酸的跨膜外运,其功能丧失显著降低植物生物量并影响花粉发育和育性。本研究通过生物信息手段对拟南芥和水稻中的跨膜蛋白14家族成员的进化关系、蛋白理化性质、结构域功能和编码基因的表达模式进行了分析,揭示了Tmemb14家族成员在单、双子叶植物进化中的功能分化,为进一步研究跨膜蛋白14家族成员的生理功能提供了理论依据。     

C-反应性蛋白与脂质体(人工膜)

本文主要叙述C-反应性蛋白(CRP)与脂质体作用激活补体的过程,影响补体激活的因素以及CRP与脂质体的结合方式(位点)。指出用脂质体(人工膜)研究CBP的特性,特别是它的生物学功能的重要性。     

螺旋脂质体的研究——Ⅰ.含有心磷脂的两相体系形成螺旋脂质体的条件

用CL(心磷脂)与DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)或DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)所组成的两组体系制备脂质体,可形成少量管状脂质体.加Ca~(2+)或其它二价阳离子后可形成单股或双股螺旋.对产生这类螺旋脂质体的各种条件进行了研究.     

科技图书

<正>结构生物学:从原子到生命(瑞典)Anders Liljas等著苏晓东等译科学出版社2015年10月出版利尔加斯编著的《结构生物学(从原子到生命)》以生物学功能为主线,以生物大分子及其复合物的三维原子结构为中心,全面深刻地解析了重要生命活动过程的结构基础及由此阐发的分子机理,内容涵盖了从蛋白质、核酸、脂类到生物膜的基本结构信息及知识,     

脂质体研究及其应用前景

前言早在60年代初,Bangham等就已发现双亲性分子(一端亲水、另一端疏水的分子)在水中将自动形成多层的封闭囊泡,其中每一层都由亲水端朝向水、疏水端彼此靠近、排列有序的二片层分子组成。他把这种结构称为片层液晶相。磷脂就是这种双亲性分子的典型代表,用磷脂充分水化后所形成的上述结构在许多方面类似于生物膜,是在分子水平研究膜结构与功能的很好的模型,因此有关这类研究工作就迅速发展起来。Sessa与Weissman于1968年正式提出脂质体这一名词,并为各国学者所公认和广为采用。虽然脂质体可能具有不同的形式,例如柱形甚至螺旋形的结构,但多数情况下以近似圆     

TLC为眼保健的起步提供技术

Liposome公司(美国)打算把其脂类、脂质体及有关技术破格给予一个眼科医生小组,这班成员已组成一个称为Eye Care America Inc.的新公司(费城).这些医生已筹集到预活动款项以着手组建一新的名为Escalon Opthalmics Inc.的服药公司,这一公司将着重于改进与眼有关的药用产品.     

鞘脂类的研究进展

鞘脂类研究是目前脂类研究的重点之一,鞘脂类研究进展有以下几方面:首先,鞘脂类具有结构上的多样性,可能的种类数量巨大;其次,人们已经克隆了大多数在鞘脂代谢途径中具有调控作用的酶类,研究的热点正在转向其调节机制;再次鞘脂类合成发生在内质网和高尔基体,通过协助扩散进行转运,CERT帮助神经酰胺从内质网到高尔基体的转运;第四,鞘脂类在细胞信号转导中起重要作用,神经酰胺和SIP是当前集中的研究对象;第五,鞘脂在脂筏的形成中具有重要作用,其特异性分布可能与脂筏的功能相关.鞘脂类的研究正在系统化,"(鞘)脂类组学"的提出有助于研究的进一步深入.     

脂代谢异常对肾病的影响

肾脏疾病发展为慢性肾衰竭是个不可逆的过程,脂质代谢的异常,对肾病患者具有重要的影响。多项实验已经证实,即使在肾病的早期阶段,也会出现不同程度的脂质及脂类代谢的异常,高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、脂联素、瘦素等脂类代谢相关物质发生改变,不仅对血浆脂代谢产生影响,对于肾小球及肾小管的结构及功能也会有一定的损伤作用。肾病患者,如肾病综合征、慢性肾衰竭等疾病,多数有肾小球及肾小管间质的损伤,肾脏的脂毒性加重肾单位的破坏。随着人们对于慢性肾脏病认识的逐渐深入,降脂治疗的普遍应用,人们普遍认为改善血浆中脂类的水平,对于肾病的治疗,尤其对于慢性肾衰竭的预防具有重要作用。     

表解真核细胞的细胞器系统

由原生质组成细胞器的四大系统,及其主要成分的形态结构和功能简表:原生质细胞器系统细胞器主要成份形态结构主要功能备注糖蛋白塘蛋白是以不均一的低聚糖为辅基的结合蛋白质蛾被蛋白质、脂类、箱类蛋白质、脂类、RNA、DNA双层脂类镶嵌着蛋白质的动态结构,呈电镜“单位膜”三层图象由两层单位膜组成。内外膜有时相连形成核孔细胞表面的保护与月滑;表面受体和疑面识别;胞间联结的分子基础物质的运输;膜受体;代谢的调节与调控;细胞识别、运动与固定质膜核被膜蛋白质、脂类、叶绿素、DNA、核蛋白体周围由两层单位膜组成。在膜内基质中分布…     

阳离子脂质体诱导的细胞氧化应激损伤

人工合成制备的阳离子脂质体作为一种重要的基因和药物载体,具有很多优点,但其对细胞的毒性作用机制尚不明确,严重影响其临床应用。该文对阳离子脂质体是否通过诱导细胞产生氧化应激反应,进而导致细胞毒性的相关作用机制进行了研究。实验使用人肺癌细胞(NCI-H460)和人胚肺正常细胞(MRC-5),采用CCK-8法、活性氧簇(ROS)荧光标记形态学观察、流式细胞术定量测定及活性氧簇自由基检测等方法,研究对比了三种头部结构不同,连接键和疏水尾部均相同的阳离子脂质体细胞毒性作用机制。这三种脂质体分别由三肽头部的N,N-双十四烷氧酰胺乙基三聚鸟氨酸酰胺(CDO14)、单季铵盐头部的N,N-双十四烷氧酰胺乙基-N,N-二甲基碘化铵(CDA14)和双季铵盐头部的1,2-双-[N-十四烷氧酰胺乙基-N,N-二甲基碘化铵]乙烷(CTA14)制备。研究结果表明,三种阳离子脂质体诱导的超氧化物、过氧化氢(H_2O_2)、羟自由基(?OH)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)等ROS均与作用剂量呈正相关,其中CDA14和CTA14高浓度处理组(0.10 μmol/L和0.20 μmol/L)与低浓度处理组(0.05 μmol/L常规转染浓度)及空白对照组相比差异极显著,而CDO14只在0.20 μmol/L处理组有显著差异,且三种脂质体对NCI-H460细胞的氧化应激损伤值均高于MRC-5细胞。因此,肽头部脂质体CDO14产生的氧化应激损伤远小于单季铵盐头部脂质体CDA14,而CDA14又小于双季铵盐头部脂质体CTA14。综上所述,阳离子脂质体诱导的细胞氧化应激损伤与其头部结构和剂量密切相关。该研究为阳离子脂质体的生物安全性及新型阳离子类脂结构设计提供科学参考。     

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)SAM结构域对激酶结构域的脂质体结合能力与激酶活性的调控研究

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph receptor) 是受体酪氨酸激酶(RTK)家族中最大的亚家族,其介导的双向信号传导对细胞的形态、黏附、运动、增殖、生存及分化都有重要的调控作用。EphA2是Eph受体家族中一个被广泛研究的重要亚型,在白内障和乳腺癌等病理发生过程中发挥了重要作用。既往研究发现:EphA2受体的激酶结构域可结合细胞膜,其激酶活性受磷脂膜的调控,但是相邻的SAM结构域对激酶结构域与脂膜的相互作用以及激酶活性的影响尚不清楚。在此项研究中,通过与磷酸酶PTP1B1-301活性片段共表达的方式,表达、纯化了EphA2受体的胞内段激酶-SAM串联结构域,通过比较胞内段激酶-SAM串联结构域与单独激酶结构域的脂质体结合能力,以及测定对应的激酶活性,发现:EphA2受体胞内段的SAM结构域使其激酶结构域与脂质体(4 mg/mL)的结合能力增强约6倍(P＜0.001);磷酸化后的EphA2胞内段激酶-SAM串联结构域结合脂质体(4 mg/mL)的能力比非磷酸化的胞内段激酶-SAM串联结构域提高2.5倍(P＜0.05);而结合脂质体后,激酶结构域的激酶活性也被进一步提高,从而形成正反馈。综上所述,本研究的发现提示:EphA2胞内段的酪氨酸激酶结构域与相邻的SAM结构域可形成一个完整的结构功能单位,其激酶活性和脂质体结合能力与单独的激酶结构域相比都形成了明显的差异,我们的这一发现对进一步理解Eph受体家族其他亚型的激酶结构域的活性调控提供了参考与思路。     

酵母线粒体的磷脂转运

线粒体是一种由两层膜包被的细胞器,其功能和结构的稳定性取决于线粒体膜上精确的磷脂组成及分布。线粒体膜上的大部分脂类物质由内质网合成,既而转运到线粒体。而部分脂类利用内质网上产生的前体,在线粒体内膜上合成。由此可见,线粒体膜脂的生物合成需要线粒体与内质网以及线粒体外膜(outer mitochondrial membrane, OMM)与内膜(inner mitochondrial membrane, IMM)之间进行大量的脂质转运。目前认为,这种运输过程既可在拴系因子(tether factors)形成的膜结合部位(membrane contact sites, MCSs)内发生,也可借助脂质转运蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)完成。近年来,研究者以酵母为对象,建立了多种线粒体磷脂转运(phospholipid trafficking)的模型,这使人们初步理解了线粒体磷脂转运的机制。本综述总结了酵母线粒体磷脂转运的最新发现,并对这些磷脂转运的模型进行了讨论,以期为今后深入了解线粒体脂类代谢提供参考。     

脂质体介导法转染肿瘤细胞效率的优化

目的:研究优化影响脂质体转染效率的因素,以提高脂质体转染效率,为相关研究和应用提供参考.方法:以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine 2000包裹pU6H1-GFP-FAK重组质粒转染Caco-2细胞,研究了细胞接种密度、DNA用量、脂质体与DNA的比例、脂质体-DNA复合物的形成时间、细胞与脂质体复合物的孵育时间、血清的有无及细胞的传代次数等因素对脂质体转染效率的影响.结果:2-5次细胞传代,2×105接种密度、4μg DNA用量、2.5:1的脂质体与DNA比例、30min脂质体-DNA复合物形成时间以及6h细胞与复合物孵育时间,转染效率最高.血清在本实验室条件下并不影响转染效率.结论:实验获得的优化条件可以明显提高脂质体对肿瘤细胞的转染效率,可作为有关研究或应用的参考.