Gap-Repair方式建立一种基于pBR322-Red的新型重组工程系统

应用Gap—Repair新技术,以pBR322为载体,在λ噬菌体Red重组酶的作用下,通过同源重组直接从大肠杆菌DY330染色体上亚克隆了长度为6．7kb的包含Red重组酶基因的λ噬菌体左向操纵子基因序列。建立了一种能够随意在不同细菌宿主中转移的基于pBR322-Red的重组工程系统。为了验证pBR322-Red的生物功能,以大肠杆菌染色体上的galk基因为靶标,用Red介导的单链DNA重组技术敲入T→G单碱基突变,使galk基因内编码第145位氨基酸的密码子由TAT转变成TAG,产生了一个琥珀突变。确定了pBR322-Red系统的重组功能。     

基于大肠杆菌受体菌DH5α △asd缺失株的构建及作为基因转化、表达操作系统的评估

基于大肠杆菌(E.coli)染色体上asd基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建E.coliDH5α的asd基因缺失突变株DH5α△asd::cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20介导二次同源重组,以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合PCR扩增和测序结果,证明DH5α△asd缺失突变株的正确构建。该缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力,只有添加DAP或导入表达asd基因的质粒(asd基因互补试验)才能在LB培养基上生长,与原型DH5α比较,其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致。基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统。体外培养连续传代50代次,pnirBMisL-fedF-asd质粒不丢失,并功能性表达F18大肠杆菌黏附素FedF。     

肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌：DH5α,用5′端与组氨酸基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大肠杆菌及其他菌株中快速、精确的构建营养缺陷型菌株提供了有益的参考。     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用PCR技术,从克隆质粒和欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB125染色体中重新扩增得到含有2酮基醛糖还原酶A和B(2KRA和B)基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌DH5α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记,再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR322上,导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换,筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢,实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2酮基古龙酸(2KLG)打下基础。     

假单胞菌M18转录调节因子σS基因与无启动子lacZ 基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern 杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β半乳糖苷酶基因（′lacZ）插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18 rpoS基因突变株M18SZ。 Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定（OD600）的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

采用Red重组系统构建包装菌株DH-gⅢ

选择感染性噬菌体技术是研究蛋白相互作用的良好手段,获得基因Ⅲ缺陷的辅助噬菌体是构成SIP体系的关键.为制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,利用λRed重组系统将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因整合到大肠埃希菌DH5α的染色体上组氨酸操纵元位点构建包装菌株,经氯霉素抗性筛选并用PCR及组氨酸表型鉴定,获得包装菌株DH-gⅢ;将缺失功能基因Ⅲ的缺陷型噬菌体基因组转化到包装菌株中培养制备辅助噬菌体,以集落形成试验来检测缺陷型噬菌体的感染能力,结果滴度可达到4.3×108,只具备一次感染力,表明包装菌株构建成功,能用来制备辅助噬菌体,有望用于SIP体系.     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法*

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌DH5α,用 5′端与组氨酸基因同源 ,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物 ,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下 ,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组 ,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因 ,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点 ,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除 ,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大     

大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在极端嗜酸性氧化硫硫杆菌中的表达

构建了含大肠杆菌磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)基因pfkA的重组质粒pSDK1,利用大肠杆菌pfk缺陷株筛选含目的基因的重组质粒,通过接合转移的方式将其导入氧化硫硫杆菌TtZ2中,接合转移频率达2.6×10-6。重组质粒在TtZ2中有较好的稳定性,在无选择压力条件下传代50次基本保持稳定(重组质粒保留68%以上)。酶活性测定、SDSPAGE及RTPCR结果表明,pfkA基因在氧化硫硫杆菌中得到表达,但其表达水平低于大肠杆菌。葡萄糖可促进含pSDK1的氧化硫硫杆菌TtZ2的生长,而对照菌株的生长则未受明显影响,说明重组菌可部分利用葡萄糖作为碳源生长。     

大肠杆菌VT噬菌体受体(vpr)基因突变株的鉴定

近年来大肠杆菌O157引起的人和动物的发病率呈上升趋势^[1-3],O157的强致病性与很多因子有关,如：粘附因子、肠溶血素(Enterohaemolysin,Ehx)、Vero毒素(Vero toxin,VTs)等。VT可致人和动物的腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合证、血栓、血球减少性紫癜等疾病^[4],是O157主要的致病因子。大量的研究表明VT是由λ家族具有vT基因的噬菌体(vT—phage)编码的^[5],且在噬菌体感染宿主菌的裂解状态时由晚期调节基因调控毒素的产生。可见大肠杆菌O157所产的vT与vT噬菌体的感染有关。大肠杆菌表面是否存在噬菌体的受体为众多科学工作者所关注,1999年Saunders等在大肠杆菌染色体中克隆出一段与VT2噬菌体敏感性有关的基因^[6],将其定名为vpr(verotoxin phage receptor)。为了进一步确定vpr基因的功能,本试验利用同源重组的方法,将已经构建的含vpr基因片段的重组自杀性质粒pYYvpr,转化到含全长vpr基因的大肠杆菌MC1061,经PCR和southern blot鉴定,获得一株染色体同源基因突变株,并对其进行生物学特性研究,初步证实该基因与噬菌体的裂解性感染有关。     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.     

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展

杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.     

Inception of the Modern Public Health System in China and Perspectives for Effective Control of Emerging Infectious Diseases: In Commemoration of the 140th Anniversary of the Birth of the Plague Fighter Dr. Wu Lien-Teh

In this article, we systematically review Dr. Wu Lien-Teh's academic achievements and outstanding contributions in the prevention and control of the plague epidemic in northeast China and introduce the development of the earliest public health epidemic prevention system in China in order to commemorate the 140th anniversary of Dr. Wu Lien-Teh's birth. We hope that this article will provide insights into the effective prevention and control of emerging infectious diseases as well as the current worldwide pandemic of COVID-19, facilitating the improvement and development of public health systems in China and around the globe.