一种新的纤溶酶原激活反应动力学研究方法

 在溶栓研究中 ,纤溶酶原激活剂 (plasminogen activator,PA)激活纤溶酶原 (plasminogen,Plg)反应的动力学常数的测定占有重要地位 .在前人的研究中 ,虽然进行了这项实验 ,但是并未给出一个方便、快捷的测定方法 .所以建立一种更准确 ,更适合一般的实验室条件的 PA分子激活 Plg反应动力学常数的测定方法是必要的 .在对该反应进行数学分析的基础上 ,得到由可测量表示的纤溶酶 (plasmin,Plm)生成速度 (v(Plm) )的计算公式 ,由 v(Plm)及相应已知量可进一步推导出 Km、kcat的表达式 ,最终测得相应动力学常数 .用这种方法测定的由甲醇酵母 (pichia pastoris)表达的人单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (human single chain urokinase- PA,scu- PA)激活 Plg的反应的 Km=0 .648μmol·L-1,kcat=0 .0 62 6s-1,与文献报导相符 (Km=0 .4～ 1 .1 μmol· L-1,kcat=0 .0 2～ 0 .0 93) s-1,说明此方法是可靠的 .又因该法只需相应底物及酶标仪且为连续测定 ,所以十分简便 .     

dsPAα1的缺失突变体的构建及其活性

纤溶酶原激活剂dsPAα1(Desmodusrotundussalivaryplasminogenactivatoralpha 1)从吸血蝙蝠(Desmodusrotundus)唾液中提取 ,它包括Finger、EGF、Kringle和蛋白酶区 .dsPAα1的功能可能与其分子结构相关 ,特别是其Finger区和EGF区 .构建、表达了缺失Finger和EGF区的dsPAα1的缺失突变体 (dsPK) ,研究dsPAα1的结构与功能的关系 .Western印迹检测 ,转染后细胞上清见dsPK条带 ;用小分子底物S2 76 5测定dsPAα1和dsPK的酶动力学常数 ,在无纤维蛋白存在下 ,两者的Km 和kcat Km基本一致 .但在纤维蛋白存在下 ,dsPAα1的kcat Km 值增加了 3 9倍 ,而dsPK仅增加了 1 6倍 ;溶栓试验显示dsPK具有溶栓作用 ,但溶栓作用显著低于dsPAα1;PAI 1对dsPAα1和dsPK具有同等的抑制作用 .证实dsPAα1的Finger结构区和EGF结构区对dsPAα1的纤溶功能是非常重要的     

肝素对组织型纤溶酶原激活剂的作用

重组组织型纤溶酶原激活剂 ( rt PA)经肝素处理后与未经处理的 rt PA比较 ,结果显示 ,rt PA在体外的溶纤活性提高 5 0 %～ 90 % ,在兔体内的半衰期延长 1 min,同时也提高了 rt PA对热的稳定性     

Ⅱ型糖尿病视网膜病变与纤溶系统的关系探讨

目的:探讨2型糖尿痛视网膜病变与纤溶系统的关系。方法:随机选取2型糖尿病视网膜痛变患者30例,无并发症患者30例,健康人30例,测定血浆纤溶酶原、纤溶酶原激活抑制物,纤溶酶原(PLG)、纤溶酶原激活抑制物(PAI-1)均采用发色底物法检测。结果:与对照组相比2型糖尿病患者血浆PLG、PAI-1水平升高(P＜0．05),糖尿病视网膜病变组升高更明显(P＜0．01)。结论:糖尿病患者血液存在低纤状态,当发生视网膜并发症者更为明显,检测2型糖尿病患者血浆PLG、PAI-1水平对糖尿痛视网膜病变的预防及治疗具有一定的临床意义。     

GL—7ACA酰化酶（C130）β亚基N端氨基酸残基的突变及功能

戊二酰 7 氨基头孢烷酸酰化酶 (即GL 7ACA酰化酶 ,EC .3.5 .1.11)的催化中心通常在 β亚基N端的第一个氨基酸 ,底物亲和标记的研究亦显示N端存在着结合靶点 ,因而该区域的结构可能与酶的功能密切相关。对C130 β亚基N端的 2～ 8位氨基酸残基分别进行了肽段置换和定点突变研究。将N端前 8位肽段置换为来源于Arthrobacterviscosus的青霉素G酰化酶 (PAC)的对应序列后 ,C130酰化酶活力丧失 ;而置换为来源于E .coli的青霉素G酰化酶 (PGA)的对应序列后 ,酰化酶活力仍然保留 ,但Km 值从 0 .44× 10 -3 mol·L-1增大为 0 .5 5× 10 -3mol·L-1,kcat值由 4.92s-1降低为 1.6 4s-1。另对C130 β亚基N端 2～ 4位氨基酸残基作了单点突变 :第 4位的Trp为可能的底物类似物结合位点 ,被变为Tyr后 ,它对底物GL 7ACA的结合能力略为减弱 ,kcat则降低为 2 .2 9s-1;而变为Leu后 ,Km 为 0 .34× 10 -3 mol·L-1,kcat为 3.15s-1;第 3位的Ser变为Met、Ala及Cys后 ,随着Km值逐渐降低 ,kcat也有所降低 ,而S3 M、S3 A突变体的kcat/Km 值比野生型的分别增加了 2 2 .3%和 39.3% ;将活性中心Ser(β1)邻位的Asn(β2 )变为Gln后 ,C130酶活大幅度下降 ,kcat减为 0 .47s-1。上述结果表明 ,C130 β亚基N端的前几个氨基酸残基均可对酶的功能     

纤维蛋白对尿激酶原激活纤溶酶原反应动力学的影响

反应体系中存在的纤维蛋白（fibrin）对尿激酶（UK）、scu-PA以及组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）激活纤溶酶原（plasminogen）的反应有不同的作用：UK、t-PA激活plasminogen的反应可被反应体系中存在的fibrin所加强;fibrin对scu-PA激活plasminogen反应的动力学常数无明显影响;但对小分子质量scu-PA与单链抗体的嵌合分子激活plasminogen的反应起明显的抑制作用.为确定反应体系中存在的fibrin对scu-PA的K区插入突变体-InB激活plasminogen反应的影响,测定了在反应体系中存在fibrin的情况下的InB激活plasminogen反应的K_m^fibrin以及k_cat^fibrin.K_m^fibrin＝4.2 μmol·L^-1,远远大于无fibrin时的K_m＝0.379 μmol·L^-1,说明有fibrin存在时突变体InB与天然底物plasminogen的亲和性降低了.k_cat^fibrin＝0.107 s^-1,也远远大于无fibrin时k_cat＝0.0165 s^-1,说明有fibrin存在时突变体InB对plasminogen的反应活性增强了.原因可能是：与fibrin结合的plasminogen的构象发生了有利于被纤溶酶原激活剂水解的变化.     

卵巢纤蛋白溶酶原激活因子及其抑制因子的研究

本文综述了近年来作者在研究卵巢纤蛋白溶酶原激活因子(PA)及其抑制因子(PAI)的某些成果。PA是一种高效能蛋白水解酶激活因子,它激活纤蛋白溶酶原成为纤蛋白溶酶,此酶在纤蛋白水解过程中起重要作用。已有证据表明,PA与排卵有关。我们进一步研究发现:(1)在大鼠卵巢体细胞中存在两种PA,即组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA);而在卵细胞中只发现tPA;(2)大鼠卵巢tPA明显受促性腺激素和其他激素调节,并在排卵前达到高峰,而uPA没有明显变化;(3)在卵巢体细胞中还发现一种PA的抑制因子(PAI),它与PA结合形成复合体,能部分或完全消除PA活性;(4)只有tPA与大鼠排卵有关;PA和PAI间的相互作用和随激素的波动而引起的动态变化可能对维持卵巢正常生理功能和排卵起重要作用。     

纤溶酶原在金黄色葡萄球菌感染中的作用

金黄色葡萄球菌菌体表面有多种纤溶酶原受体,包括次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶、核糖核苷酸还原酶、α-烯醇化酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶等,它们均可以与纤溶酶原结合。与细菌结合的纤溶酶原可被宿主的纤溶酶原激活剂(组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂)或葡萄菌属的纤溶酶原激活剂(葡激酶)激活为纤溶酶。细菌表面的纤溶酶有利于其降解宿主胞外基质,穿越组织屏障,因此哺乳动物的纤溶酶原可能在金黄色葡萄球菌感染宿主过程中起重要作用。     

表达人PAI-1的重组腺病毒的制备及检测

人纤溶酶原激活剂抑制物1（PAI-1）基因与复制缺陷型腺病毒载体AdCMVHSgD重组,与pJM17质粒共转染293细胞,采用不铺琼脂的方法产生重组病毒.PCR证实PAI-1基因重组进入腺病毒.进一步感染B16（F10）细胞,细胞表面洗提物和上清分别经纤维显示胶和反向纤维蛋白显示胶检测PAI-1抑制纤溶酶原激活剂（PA）的活性.     

同型半胱氨酸对人脐静脉血管内皮细胞tPA 及PAI-1基因表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对纤溶系统的影响,观察Hcy在转录水平对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)的影响。方法将体外培养的HUVEC分为生理浓度(10μmol/LHcy)组,病理浓度(50、200、500μmol/L)Hcy组及单纯培养基组(0μmol/LHcy),培养24h后,提取RNA,反转录聚合酶链反应分析(RTPCR)法分析各组tPA及PAI1基因表达水平。结果500μmol/LHcy组与10μmol/LHcy组相比,tPAmRNA基因表达明显下调(P<0.05),PAI1mRNA表达则明显上调(P<0.05)。而与单纯培养基组相比,10μmol/LHcy组tPAmRNA表达明显增高(P<0.05)。结论生理浓度Hcy可以增加纤溶系统活性,减少血栓性疾病的发生。高Hcy(病理浓度)则抑制纤溶系统活性,促进缺血性心脑血管疾病的发生。     

PRGDWR-尿激酶原双功能嵌合分子的性质研究

为赋予单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single chain urokinase-type plasminogen activator, scu-PA, 尿激酶原)以抗血小板聚集的功能,在scu-PA的kringle区118位Gly与119位Leu之间插入PRGDWR序列（insert mutant B,InB）.利用甲醇酵母（Pichia pastoris）进行分泌表达,经金属离子螯合亲和层析与S强阳离子交换层析,得到纯蛋白.实验测定InB对人工合成底物S-2444的酰胺解活性为5 900 IU/mg,动力学常数为：K_m,S-2444^InB=56.8 μmol·L^-1,k_cat,S-2444^InB=0.33 s^-1;水解天然底物plasminogen的动力学常数为：K_m,plg^InB=0.397 μmol·L^-1,k_cat,plg^InB=0.0164 s^-1.InB激活plasminogen的反应在有fibrin存在条件下InB的活性为无fibrin条件下的46.3％.该突变体在体外激活plasminogen的活性与同一系统表达的野生型scu-PA基本相同.该突变体表现出较强的抗血小板聚集活性,IC₅₀＝12.7 μmol·L^-1,而野生型scu-PA无此功能.实验表明scu-PA的K区插入突变体InB是一种极具潜力的双功能溶栓分子.     

凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的构建、表达、纯化和性质研究

用Ｋｕｎｋｅｌ突变法,将单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｓｃｕ－ＰＡ）ｃＤＮＡ基因中编码Ｐｒｏ１５５—Ｌｙｓ１５８的片段定点突变,并将此突变的ｓｃｕ－ＰＡ（ｔｓｃｕ－ＰＡ）的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣＭ－β－ｎｅｏ中,与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞．获得的稳定表达株在无血清培养基中２４ｈ的表达量为６２０ＩＵ／１０６细胞．经锌离子螯合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析得到ｔｓｃｕ－ＰＡ纯品．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示ｔｓｃｕ－ＰＡ分子量为５３ｋＤ左右,与预期的结果相符．ｔｓｃｕ－ＰＡ是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活,但激活后也能转变为双链分子（ｔｃｕ－ＰＡ）．ｔｓｃｕ－ＰＡ仍保持了ｓｃｕ－ＰＡ的血纤维蛋白亲和性．酶动力学研究表明,激活后的ｔｓｃｕ－ＰＡ水解Ｓ２４４４的Ｋｍ和Ｋｃａｔ值与高分子量尿激酶（ＨＵＫ）相似．体外溶栓实验结果表明,ｔｓｃｕ－ＰＡ可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块,对贫凝血酶的血凝块作用不大     

蚯蚓纤溶酶原激活剂(e-PA)小亚基活性中心的酶学性质及CD光谱的研究

蚯蚓纤溶酶原激活剂（ｅ－ＰＡ）具有多种底物特异性．对构成其的小亚基的活性中心的研究有利于阐述ｅ－ＰＡ的结构与功能的关系．利用胰蛋白酶的特异性抑制剂ＴＬＣＫ（Ｎ－α－ｐ－ｔｏｓｙｌ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）对小亚基进行抑制活性的研究,结果表明ＴＬＣＫ对酶促反应的抑制曲线与可逆抑制曲线相似,但在抑制剂存在下的最大反应速度与抑制剂不存在时的最大反应速度不同．结合小亚基在ＴＬＣＫ存在下的ＣＤ光谱变化,证明了小亚基分子表面存在两个活性位点,这两个活性位点对ＴＬＣＫ的敏感性不同,从而造成ＴＬＣＫ抑制行为的异常．推测不同的活性结构对应于不同的底物特异性．     

重组人糖基化单链尿型纤溶酶原激活剂中试生产中蛋白含量测定方法的比较

在单链尿型纤溶酶原激活剂中试生产中 ,用不同的方法对产品蛋白含量进行测定 ,得到的结果常常存在很大差异。通过对紫外法和 Lowry法的比较分析 ,我们认为紫外法更适用于单链尿型纤溶酶原激活剂生产中的产品的蛋白含量测定     

Kinetics of activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFIa)-catalyzed cleavage of C-terminal lysine residues of fibrin degradation products and removal of plasminogen-binding sites

Partial digestion of fibrin by plasmin exposes C-terminal lysine residues, which comprise new binding sites for both plasminogen and tissue-type plasminogen activator (tPA). This binding increases the catalytic efficiency of plasminogen activation by 3000-fold compared with tPA alone. The activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFIa) attenuates fibrinolysis by removing these residues, which causes a 97% reduction in tPA catalytic efficiency. The aim of this study was to determine the kinetics of TAFIa-catalyzed lysine cleavage from fibrin degradation products and the kinetics of loss of plasminogen-binding sites. We show that the k(cat) and K(m) of Glu(1)-plasminogen (Glu-Pg)-binding site removal are 2.34 s(-1) and 142.6 nm, respectively, implying a catalytic efficiency of 16.21 μm(-1) s(-1). The corresponding values of Lys(77)/Lys(78)-plasminogen (Lys-Pg)-binding site removal are 0.89 s(-1) and 96 nm implying a catalytic efficiency of 9.23 μm(-1) s(-1). These catalytic efficiencies of plasminogen-binding site removal by TAFIa are the highest of any TAFIa-catalyzed reaction with a biological substrate reported to date and suggest that plasmin-modified fibrin is a primary physiological substrate for TAFIa. We also show that the catalytic efficiency of cleavage of all C-terminal lysine residues, whether they are involved in plasminogen binding or not, is 1.10 μm(-1) s(-1). Interestingly, this value increases to 3.85 μm(-1) s(-1) in the presence of Glu-Pg. These changes are due to a decrease in K(m). This suggests that an interaction between TAFIa and plasminogen comprises a component of the reaction mechanism, the plausibility of which was established by showing that TAFIa binds both Glu-Pg and Lys-Pg.     

The 99 and 170 loop-modified factor VIIa mutants show enhanced catalytic activity without tissue factor

To elucidate the functions of the surface loops of VIIa, we prepared two mutants, VII-30 and VII-39. The VII-30 mutant had all of the residues in the 99 loop replaced with those of trypsin. In the VII-39 mutant, both the 99 and 170 loops were replaced with those of trypsin. The k(cat)/K(m) value for hydrolysis of the chromogenic peptidyl substrate S-2288 by VIIa-30 (103 mm(-)1s(-)1) was 3-fold higher than that of wild-type VIIa (30.3 mm(-)1 s(-)1) in the presence of soluble tissue factor (sTF). This enhancement was due to a decrease in the K(m) value but not to an increase in the k(cat) value. On the other hand, the k(cat)/K(m) value for S-2288 hydrolysis by VIIa-39 (17.9 mm(-)1 s(-)1) was 18-fold higher than that of wild-type (1.0 mm(-)1 s(-)1) in the absence of sTF, and the value was almost the same as that of wild-type measured in the presence of sTF. This enhancement was due to not only a decrease in the K(m) value but also to an increase in the k(cat) value. These results were in good agreement with their susceptibilities to a subsite 1-directed serine protease inhibitor. In our previous paper (Soejima, K., Mizuguchi, J., Yuguchi, M., Nakagaki, T., Higashi, S., and Iwanaga, S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 17229-17235), the replacement of the 170 loop of VIIa with that of trypsin induced a 10-fold enhancement of the k(cat) value for S-2288 hydrolysis as compared with that of wild-type VIIa in the absence of sTF. These results suggested that the 99 and the 170 loop structures of VIIa independently affect the K(m) and k(cat) values, respectively. Furthermore, we studied the effect of mutations on proteolytic activity toward S-alkylated lysozyme as a macromolecular substrate and the activation of natural macromolecular substrate factor X.     

Rescue of the orphan enzyme isoguanine deaminase

Cytosine deaminase (CDA) from Escherichia coli was shown to catalyze the deamination of isoguanine (2-oxoadenine) to xanthine. Isoguanine is an oxidation product of adenine in DNA that is mutagenic to the cell. The isoguanine deaminase activity in E. coli was partially purified by ammonium sulfate fractionation, gel filtration, and anion exchange chromatography. The active protein was identified by peptide mass fingerprint analysis as cytosine deaminase. The kinetic constants for the deamination of isoguanine at pH 7.7 are as follows: k(cat) = 49 s(-1), K(m) = 72 μM, and k(cat)/K(m) = 6.7 × 10(5) M(-1) s(-1). The kinetic constants for the deamination of cytosine are as follows: k(cat) = 45 s(-1), K(m) = 302 μM, and k(cat)/K(m) = 1.5 × 10(5) M(-1) s(-1). Under these reaction conditions, isoguanine is the better substrate for cytosine deaminase. The three-dimensional structure of CDA was determined with isoguanine in the active site.