A型产气荚膜梭菌α-毒素基因的克隆与核苷酸序列分析

利用聚合酶链式反应(PCR)技术,从A型产气莫膜梭菌染色体基因组中扩增了1．2kb的α毒素基因。通过T4 DNA连接酶,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化受至体菌JM109中,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI双酶切分析,证明重组质粒pXCPA02中含有A型产气荚膜棱菌α毒素全基因。经核苷酸序列分析,明确了克隆的α毒素基因在重组质粒中的连接向位且核苷酸序列是正确的。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆及结构分析

应用PCR技术,从产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中,扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素基因C端片段(cpa408),并将其克隆至pMDl8-T载体中．经转化,α互补蓝白菌落选择培养,提取质粒,进行PCR和Eco RⅠ、PstⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆．经核苷酸序列分析证实,cpa408基因阅读开放框架由372个核苷酸组成,编码124个氨基酸．经计算机分析,cpa408基因序列与国外文献报道的A型产气荚膜梭菌α毒素基因C端片段同源性达99％以上,表明所克隆的基因即为α毒素基因C端片段．     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因的高效表达

用NooI/EcoRI酶切含α毒素基因质粒pXCPA02,回收1.2kb的α毒素基因片段,通过T4 DNA连接酶,将回收的α毒素基因片段与经NcoI/Eco RI酶切的表达载体pET-28c连接,转化至受体菌BI21(DE3)中,经NcoI/EcoRI,BamHI/Eco RI和NcoI/BamHI/Eco RI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实,获得的表达质粒aXETA02含有α毒素基因,而且阅读框架是正确的.重组菌株BL21(DE3),(pXETA02)经IPTG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的36.83%.     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1．2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPAl中含有α毒素全基因。随后用NcoI／EcoRI酶切质粒pXCPAl,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXAl,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXAl)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16．28％。     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎,肠毒血症,人类的食物中毒和战创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,该菌分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ６型,其致病因子是菌体产生的外毒素。到目前为止,已发现的外毒素有１２种之多,但各型产气荚膜梭菌均产生α毒素（ＣＰＡ）,故以α毒素最为重要。近年来,国外学者对α毒素的组成,结构,作用机制及分子遗传学等方面都作了较为深入的研究,现将有关情况介绍如下。     

重组A型产气荚膜梭菌α毒素C端片段的分离纯化

押在构建出高表达、高活性的A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原工程菌株pBV/cpa408的基础上,对表达产物进行了分离纯化研究。诱导表达菌液离心后,超声破碎沉淀细菌,上清用80%饱和硫酸铵沉淀,沉淀蛋白经透析,上凝胶过滤层析柱分离纯化,得到纯度达95%以上的表达目的蛋白,经SDS-PAGE测定,相对分子质量为15.5×103,序列与文献报道的相符。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达*

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1.2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPA1中含有α毒素全基因。随后用NcoI/EcoRI酶切质粒pXCPA1,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXA1,经NcoI/EcoRI和BamHI/E     

C型产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了0．72kb的β2毒素基因,将纯化的PER产物与载体pGEM—T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／Bam HI和Bam HI／Eco RI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPB2中含有陡毒素基因。随后用Nco I／Bam HI酶切质粒pXCPB2,回收β2毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXB2,经Nco I／Bam HI和Nco I／Hind Ⅲ／Bam HI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有陡毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21（DE3）（pETXB2）表达产物经ELISA检测和SDS—PAGE分析,重组菌株表达的β2毒素蛋白能够被如毒素抗体识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的13．26％。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆和表达

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出抗体V_H 和V_L 基因 ,连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中构建了重组质粒pXScFv 2E3。经序列分析证实 ,V_H 和V_L 基因及linker基因拼接正确 ,基因全长为 726bp ,编码 242个氨基酸。随后将其定向克隆于表达载体pHOG21,转化至大肠杆菌XL1 BLUE筛选出表达菌株XL1 BLUE(pHOG 2E3)。经ELISA和SDS PAGE分析表明 ,在20℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 25 %。并且ScFv基因表达产物能够中和α毒素的磷酯酶C活性     

C型产气荚膜梭菌β1毒素基因表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出β1毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对其进行双酶切处理,回收0．95kb的β1毒素基因片段,最后将其定向克隆在事先经同样内切酶处理的载体pET-28c中相应位点上,转化至受体菌B121(DE3)qh。经BamHI和Eco RI双酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXBl含有B毒素基因,并且具有正确的基因序列和阅读框架。重组菌株BI21(DE3)(pETXB1)经IPIG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达β1毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的12．24％。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

A型产气荚膜梭菌α毒素Thr-272基因定点突变与结构分析

利用定点突变技术,将A型产气荚膜梭菌α毒素( CPA)第272位苏氨酸(ACA)定点突变成脯氨酸(CCG),构建了含CPA突变基因表达质粒的重组菌株BL21( DE3)(pMCPA-T272P).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pMCPAT272P含有CPA-Thr272Pro突变基因,且基因序列和阅读框架正确.重组菌株BL21( DE3)(pMCPA-T272P)表达产物经SDSPAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的18.34％.应用ExPASy服务器上的SOPMA法对CPA和CPA-Thr272Pro突变体分子进行二级结构预测,同时模拟了其3D结构.结果显示,CPA和CPA-Thr272Pro突变体蛋白的二级结构主要是由α-螺旋和无规则卷曲组成,3D结构非常相似.CPA和CPA-Thr272Pro突变体蛋白的圆二色(CD)光谱分析发现二者的CD光谱有一些微小变化.磷脂酶C活性检测结果表明,CPA-Thr272Pro突变体蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性.免疫试验结果表明,用CPA-Thr272Pro突变体蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击.     

产气荚膜梭菌毒素的研究进展

本文简要介绍产气荚膜梭菌（ＣＰ）α,τ,ε,λ,θ毒素及肠毒素的基本结构,生物学活性和致病机制的研究进展。     

重组A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因在大肠杆菌中的高效表达

在成功克隆A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因(cpa408基因)后,发现基因N端ATG后密码子在大肠杆菌中的使用频率普遍偏低,在不改变氨基酸的前提下,对N端基因进行修饰,构建重组表达质粒pBV220cpa408,导入大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,cpa408基因获得了高效表达,表达量达菌体总蛋白的4375%,表达产物以可溶形式存在。经Westernblot分析,表达产物能被标准抗α毒素血清识别。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆、表达及其生物学活性(英文)

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中 .经核苷酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及linker基因拼接正确 ,ScFv 1A8基因全长为 72 6bp ,编码2 4 2个氨基酸 ,VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ (A)和轻链κⅣ家簇 .将ScFv 1A8基因克隆至表达载体pHOG2 1中 ,构建了重组质粒pHOG 1A8,然后转化至受体菌XL1 BLUE中 ,得到重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8) .ELISA检测和SDS PAGE分析表明 :经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8)的胞周质中 .经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE(pHOG 1A8)的蛋白表达产物占菌体可溶性蛋白的 1 2 % ,其相对分子量约为 31kD .ScFv的生物学活性研究表明 ,ScFv蛋白不但具有中和磷脂酶C的活性 ,而且还能够对致死性腹腔攻击的小鼠产生良好的被动保护作用     

C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1融合基因表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1)。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1融合蛋白能够被α、β1毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5944毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

C型产气荚膜梭菌β1、β2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

多重PCR鉴定不同毒素型的产气荚膜梭菌菌落

参照文献报道的产气荚膜梭菌a, b, e, t 毒素基因cpa、cpb、etx 及iA序列合成了针对4种毒素基因的4对特异引物, 建立了一种简单的产气荚膜梭菌定型的菌落多重PCR方法。结果本所保存的A, B, C, D, E各型产气荚膜梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期条带, 而诺维氏梭菌、腐败梭菌和破伤风梭菌的扩增均为阴性; 将单个菌落稀释100倍利用此菌落多重PCR仍能扩增到相应的目的片段。并利用此多重PCR对13株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行了定型鉴定, 并与毒素中和试验鉴定结果进行了比较, 结果表明两种方法具有较高的符合率。本方法的建立对于产气荚膜梭菌的快速检测、定型具有十分重要的意义。     

A型产气荚膜梭菌经小鼠传代的毒力变化

目的:探讨A型产气荚膜梭菌经小鼠腹腔传代后的毒力变化。方法:选择10只小鼠,腹腔注射浓度为5.0×108 cfu/mL的A型产气荚膜梭菌菌液1 mL,记录第一代小鼠存活时间;收集第一代死亡最早的小鼠腹腔内的细菌,经血平板厌氧培养24 h后配制5.0×108 cfu/mL浓度的菌液,并腹腔注射10只小鼠,每只1 mL,记录第二代小鼠存活时间;重复实验并记录第三代、第四代小鼠的存活时间;死亡小鼠腹腔收集的细菌以革兰染色涂片镜检,血平板培养,用API 20A试剂条进行生化鉴定;用SPSS 13.0软件分析每代小鼠的存活时间组间差异。结果:小鼠腹腔收集的标本经革兰染色后均可见两端钝圆棒状的革兰阳性杆菌,血平板厌氧培养均为边缘呈锯齿状有双溶血环的较大菌落,API 20A的结果为产气荚膜梭菌;小鼠存活时间随小鼠腹腔传代数不断延长,第一代与第二代、第三代、第四代之间的存活时间差异有统计学意义,第二代、第三代与第四代两两之间的存活时间差异无统计学差异。结论:A型产气荚膜梭菌经小鼠腹腔第一次传代后毒力显著减弱,随后传代中毒力基本不变,与传统的细菌经动物腹腔培养后毒力增强的观点不一致。     

产气荚膜梭菌双圈溶血现象之培养及其毒素分析

通过实验介绍了产气荚膜梭菌在血琼脂平板上经数次传代培养后恢复毒力产生双圈溶血现象的培养方法,并阐明了导致该现象产生的两种毒素(θ毒素和α毒素)的作用机理。