人体淋巴细胞和中国仓鼠杂种细胞FD1的建立和鉴定

本文以中国仓鼠肺细胞Wg3-h(HGPRT~-)和正常人的淋巴细胞作为亲本,借助仙台病毒促融,HAT培养液选择得到FD1杂种细胞。通过观察细胞形态、Giemsa-11分化染色,G-分带、G-6-PD和LDH同工酶的电泳等一系列鉴定指标,以及细胞周期的研究,证实FD1细胞是包含全套中国仓鼠染色体组和少数几条人的染色体(5、11、12、21、22、xq~-、Y等)的杂种,其中还存在中国仓鼠和人体染色体的易位。FD1等杂种细胞的建立将有助于进行人类基因制图以及人体基因的结构功能和表达调控的研究。     

G6PD通过细胞周期蛋白D1/D2调控人黑色素瘤细胞周期的进程

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在人皮肤黑色素瘤A375细胞中处于高表达与高活性状态, 但G6PD在黑色素瘤发生发展过程中的作用及其具体机制尚不明确.本文在前期运用 siRNA方法构建G6PD敲减的黑色素瘤A375稳转细胞(A375-G6PDΔ)基础上,构建表达载体pBabe-puro-G6PDWT在A375-G6PDΔ细胞中过表达野生型的G6PD基因,从而构建G6PD表达恢复的稳转细胞(A375-G6PDΔ-G6PDWT).3株细胞A375-WT、A375-G6PDΔ和 A375-G6PDΔ-G6PDWT经G6PD酶活性测定、MTT测定、克隆形成实验、流式细胞仪分析细胞周期和Western 印迹检测.结果显示,A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞的G6PD蛋白表达量 (0.847 ± 0.080)及其活性(0.394 ± 0.029)分别是A375-G6PDΔ的3.28倍(P＜0.01) 和7.34倍(P＜0.01),分别是A375-WT细胞的91-57%和2.12倍(P＜0.05).与A375-WT细 胞相比,A375-G6PDΔ细胞G0/G1期细胞数增加,S期细胞数减少,增殖指数PI降低了25-70%（P＜0.05）,细胞周期蛋白D1/D2、细胞周期蛋白E表达分别下降37.4%、54.3% (P＜0.01)和17.3%;而A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞呈现G1/S期阻滞解除,细胞周期蛋白D1/D2蛋白分别恢复到A375-WT细胞的89.5%和87.6%,细胞周期蛋白E表达未见 恢复,呈现生长增殖和克隆形成率的恢复并接近于A375-WT细胞. 结果提示,G6PD通 过细胞周期蛋白D1/D2调控人皮肤黑色素瘤A375细胞G1期向S期转换的进程,这为黑色 素瘤发病机制的研究提供了新的思路.     

G6PD缺陷抑制人黑色素瘤细胞裸鼠移植瘤的生长

敲减葡糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)表达的人黑色素瘤A375细胞(A375-G6PDΔ) 呈现生长增殖抑制和凋亡率升高. 为明确G6PD缺陷对裸鼠体内成瘤的影响及其可能机制,用A375-WT与A375-G6PDΔ细胞制作裸鼠荷瘤模型,观察体内瘤体生长,real-time PCR、免疫组织化学染色与紫外分光光度法分别检测瘤体组织G6PD mRNA、G6PD蛋白及酶活性,Western 印迹分析凋亡相关蛋白,分光光度法测定NADPH和GSH/GSSG水平. 结果显示,A375-G6PDΔ细胞注射组的裸鼠成瘤时间延长,瘤体生长明显减慢,瘤体的体积与质量显著低于A375 WT细胞注射组（P <0.01）;与A375-WT细胞注射组相比,A375 G6PDΔ细胞注射组的裸鼠瘤体组织中G6PD mRNA表达、G6PD阳性细胞数与G6PD活性分别降低了87.10%、77.20%与75.77%（P<0.01）,G6PD、p53和Bcl-2的表达分别降低了67.92%、65.54%和62.32%（P<0.01）,Fas升高了86.38%（P<0.01）,NADPH和GSH/GSSG分别降低了74.37%和86.02%（P<0.01）. 结果提示,G6PD缺陷可能通过减少核酸等合成的原料、改变细胞内氧化还原状态及凋亡相关蛋白表达抑制裸鼠瘤体生长与增殖,这为黑色素瘤发生和治疗研究提供了新的线索.     

异常激活的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶通过上调周期蛋白D1表达促进肾透明细胞癌增殖

葡萄糖6-磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD）为磷酸戊糖途径的调节酶。研究表明,G6PD与多种恶性肿瘤的发生密切相关。然而,G6PD在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）中的功能及其作用机制却鲜有报道。本研究通过TCGA数据分析发现,G6PD在肾透明细胞癌TNM Ⅲ/Ⅳ期mRNA表达水平显著升高,与患者的性别、原发肿瘤直径、淋巴结转移、远端转移、病灶一侧的偏重性、病理分级以及TNM临床分期密切相关。并且,G6PD异常激活有可能成为评价肾透明细胞癌患者不良预后的分子。细胞系检测结果提示,与对照293T细胞及恶性程度较低的786-O细胞相比,恶性程度较高的Caki-1细胞中的G6PD表达及活性明显增加。基因稳定转染结合CCK8分析结果显示,G6PD过表达或异常激活可显著提高293T及786-O细胞的增殖能力,并且促进786-O细胞中周期蛋白D1基因表达上调。综上,本研究通过TCGA数据库分析和稳定细胞系检测及CCK8分析,结果显示,G6PD在肾透明细胞癌中异常激活,并可上调细胞周期蛋白D1表达,进而促进肿瘤细胞增殖。该研究为进一步揭示肾透明细胞癌分子发病机制以及开发有效的靶向治疗方案提供了借鉴。     

G6PD缺陷通过Caspase-3和PARP-1诱导人黑色素瘤细胞凋亡

葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在许多肿瘤细胞中高表达,但其发生的作用机理目前仍然不明确.以正常人表皮黑色素细胞(HEM)、野生型人黑色素瘤A375细胞(A375-WT)和G6PD缺陷的A375细胞(A375-G6PDΔ)为对象,经real-time PCR、Western印迹和紫外分光光度法分析显示,A375-WT细胞的mRNA、G6PD蛋白和G6PD活性分别是HEM细胞的1.89倍(P0.05)、6.86倍(P0.01)和2.30倍(P0.05).Annexin V/PI流式细胞仪和Western印迹测定表明,A375-G6PDΔ的凋亡率是A375-WT的5.10倍(P0.01),活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)增高1.84倍(P0.01)以及89 kD多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)生成增加2.87倍(P0.01).分光光度法分析显示,A375-G6PDΔ的NADPH和GSH分别降低了72.30%(P0.01)和27.39%(P0.05),并伴有75.43%的H2O2增高(P0.01).结果提示,G6PD在黑色素瘤细胞中高表达和高活性,而敲减G6PD表达通过caspase-3和PARP-1信号诱发人黑色素瘤细胞凋亡,这为深入揭示黑色素瘤的发生机理提供了新思路。     

微细胞介导人14号染色体自A9细胞转移至DT40细胞

为了获得含人14号染色体的DT40细胞,用于人抗体基因的表达研究.本研究利用微细胞介导的染色体转移技术,将A9细胞中的人14号染色体转移至DT40细胞中.首先,摸索秋水仙胺诱导A9细胞微核形成最佳浓度与最佳时间,以终浓度为10 mg/mL的细胞松驰素B破坏细胞骨架,离心分离微细胞,获得的微细胞依次经8μm、5μm、3μm滤膜过滤后与受体细胞DT40融合,细胞铺板后加入G418筛选.然后,对长出的抗性克隆进行基因组DNA检测及FISH杂交,分析人14号染色体在DT40杂合细胞克隆中的存在情况.结果显示,成功获得含人14号染色体的DT40(#14)细胞,三轮试验共获得抗性克隆30个,人14号染色体有效转移率为1×10-6.实验结果表明,人14号染色体完整的自A9细胞转移至DT40细胞,获得的DT40(#14)细胞可用于制备含人抗体基因的人类人工染色体,用于人抗体基因的表达研究.     

四细胞杂交克隆的NORs活性和均染区的巨染色体

通过聚乙二醇使3个小鼠细胞与1个中国仓鼠骨髓细胞融合,获得四细胞杂交克隆。在第6世代,该杂种细胞含有100条小鼠染色体和5条仓鼠染色体。本文报道在杂种细胞中双亲NORs活性均受抑制,不仅73.2％的仓鼠NORs活性被抑制,而且还有18.3％的小鼠NORs失去了活性。由于在杂种细胞中,仓鼠第3号染色体上的NORs活性仍保留它原来的91.2％,因此我们的结果表明:不同染色体上18s和28s rRNA基因的转录活性可有明显的差异,这可能与它们所在的染色体结构有关。我们首次报道了杂种细胞中所出现的均染色区巨染色体,并对这条巨染色体进行了G-带、C-带和Ag-NORs的分析。对这条巨染色体与18s和28srRNA基因扩增的关系进行了初步讨论。     

人—小鼠淋巴细胞杂交瘤中抗体分泌和人染色体丢失的关系

本文应用G带,G11和C带染色体制片的方法分析16个人一小鼠杂交瘤抗体分泌和人染色体丢失的关系。结果表明抗体阳性的9株杂交瘤保留人的染色体较多,7/9在13条以上,阴性的7株中4/7在5条以下。Ig基因相关的三对人染色体中,14号(重链基因相关)最稳定,22号(入链基因相关)其次,2号(K链基因相关)最易丢失。9株以SHM-D33为融合亲本瘤系的杂交瘤,没有1株保留第2号染色体,而用RF瘤系建立的4株杂交瘤中有3株拥有2号染色体,提示2号的丢失可能也与瘤系相关。     

葡萄糖6-磷酸脱氢酶调控细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白依赖性激酶2促进细胞增殖及其在肾透明细胞癌中的预后价值

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一种转移率高、预后差的细胞代谢性疾病,对其有效诊疗及预后分子标志物的研究十分重要。葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase, G6PD)在ccRCC中高表达,并提示患者不良预后,其促进ccRCC细胞增殖的分子机制有待进一步揭示。本研究发现,降低G6PD可抑制细胞周期G₁/S期转化并显著抑制ccRCC细胞增殖。G6PD可在细胞水平调控G₁/S期转化及增殖相关因子Cyclin D1,CDK4,CDK6,Cyclin E1和CDK2基因表达。TCGA数据库分析结果表明,ccRCC 中Cyclin D1,Cyclin E1 和 CDK2的mRNA 水平显著升高,而CDK4表达无明显差异,CDK6表达却显著降低。相关性分析结果显示,G6PD与Cyclin D1呈显著负相关(P<0.0001),G6PD与CDK4,CDK6之间无显著相关性(P>0.05),G6PD与Cyclin E1(P<0.0001)以及CDK2(P<0.05)显著正相关。进一步免疫组化检测结果表明,Cyclin E1和 CDK2在ccRCC肿瘤组织中表达显著升高。生存预后分析结果显示,Cyclin D1高表达提示ccRCC患者整体预后更为良好,CDK4和CDK6表达水平在ccRCC患者总生存率预测中无意义;而Cyclin E1和CDK2高表达均可提示ccRCC患者预后不良。进一步细胞水平检测发现,Cyclin E1、CDK2表达降低可显著逆转G6PD促进ccRCC细胞增殖的能力。综上,与增殖相关因子Cyclin D1,CDK4和CDK6相比,G6PD有可能通过促进Cyclin E1和CDK2表达升高而发挥促进 ccRCC肿瘤细胞增殖的作用,并且这3者的异常高表达有望成为ccRCC患者不良预后的独立生存预测因素。     

siRNA沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及凋亡的影响

研究表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与肿瘤的发生、发展、临床表型及治疗和预后有关.为阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理,针对人G6PD基因设计3条siRNA和一条无关序列,再据每一序列,合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-u6.2/Lenti连接,转染人皮肤黑色素瘤A375细胞,Real-time PCR筛选有效的一条siRNA,经病毒颗粒包装和病毒生产并感染A375细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,Western blotting检测siRNA干扰G6PD效率为88.83%,构建成G6PD缺陷型A375稳转细胞(A375-G6PDA).与野生型A375细胞(A375-WT)比较,A375-G6PD△的G6PD活性仅为21.53%,细胞倍增时间延长,增殖被抑制,克隆形成率降低25%(P0.05),提示,G6PD缺陷可能通过下调P53蛋白表达和上调Caspase.3的表达,抑制G2/M期向G0/G1期转换的进程,促进A375的凋亡,机理有待于进一步探讨.     

雌性畸胎瘤细胞离体分化时X染色体的行为

用雌性畸胎瘤LT细胞(具有两个X染色体)为材料,在离体条件下诱导分化。通过对X连锁的HPRT和G6PD等酶的定量分析,并与Pcc3/A/1畸胎瘤细胞(XO型)对比。结果表明,HPRT与G6PD酶比活性在分化后的LT细胞中,以及在已分化的胚胎体重新种植并传代后的细胞中,均与Pcc3/A/1(XO型)细胞相似,比未分化的细胞降低了一半左右。这些结果可认为,在雌性畸胎瘤细胞离体分化过程中,发生了X染色体的生化分化。     

人体肺腺癌细胞系LTEP-a1的高分辨染色体研究

应用低浓度秋水仙素处理的方法,对人肺腺癌细胞系LTEP-a1的早中期细胞进行G显带分析。该细胞系第20代培养细胞的染色体众数为100—110,每细胞中有正常染色体32—52条,异常染色体47—73条。共发现17个可以识别其结构的恒定标记染色体,其中有6个涉及1号染色体的断裂和重排,断裂点分别位于lp22、lq11和着丝粒附近。lP31 p36的缺失是作者所分析的3个人肺腺癌细胞系中共有的染色体异常,这一细胞遗传学的改变可能与人肺腺癌的生成有重要联系。     

人类GABARAPL2基因的染色体定位

为了确定人类GABAA受体相关蛋白相似蛋白2基因在染色体上的位置,根据该基因cDNA的3′非翻译区序列设计一对RH定位引物,以人／鼠体细胞腹辐杂种板Genebridge4(GB4)panel和G3panel试剂盒中的杂种细胞株基因组DNA为模板,在一定的条件下进行PCR扩,琼脂糖凝胶电泳结果分别插入Sanger和Stanford网站的RH定位分析系统进行统计学分析。结果PCR法在一些杂种细胞株中扩增出特异的目的片段,并经测序验证了其准确性。凝胶电泳结果在Sanger网站统计分析表明该基因与16号染色体上的AFM340ye5,AFM292xh5,AFM320wf1,AFMa066xd5,AFM249xc5位标紧密连锁;在Stanford网站统计分析表明该基因片与16号染色体上的SHGC－1457,SHGC－53415,SHGC－6782,SHGC－2228,SHGC－14629位标紧密连锁,LOD值均大于3。整合分析该染色体区带的物理图、遗传图及细胞图谱后,最终将基因定位在染色体16q22.3区带的D16s3016和D16s515位标之间。结论放射杂交定位法是一种新颖便捷的基因定位的方法,通过此法成功地进行了人类GABAA受体相关蛋白相似蛋白2基因的定位。     

小鼠杂交细胞生物学特征的观察

本文用小鼠NS—1骨髓瘤细胞与小鼠脾淋巴细胞经PEG介导进行融合,通过HAT选择,有成效地获得了同种杂种细胞。在融合后第30、50、70、90天观察了杂种细胞的染色体畸变和间期细胞核损伤,并对亲本和杂种细胞的染色体核型、带型(G带、C带)进行了比较。 结果表明:NS—1细胞系的染色体平均数为64.2条,有一条标记性的亚中着丝粒染色体及一条微小染色体。小鼠脾淋巴细胞染色体为2n=40,全部为端着丝粒染色体。NS—1/小鼠脾淋巴细胞融合后的杂种细胞,染色体平均数随融合后杂种的传代而逐渐减少。到第70天时已稳定,平均为80.7±6.2条。同时,随融合后传代,杂种细胞染色体畸变率和核碎裂也增加。 最后对染色体丢失的机理及意义以及饲养细胞在融合中的作用进行了初步讨论。     

云南阿昌族G6PD基因突变G487A在DF213中的表达

为获得阿昌族G6PDWT和G6PDG487A重组蛋白,研究G6PDG487A的结构和功能改变,从云南省德宏州梁河县杞木寨乡湾中村阿昌族聚集地的G6PD缺陷家系先证者和正常阿昌族个体全血提取RNA,经RT-巢式PCR得cDNA,将cDNA克隆至pMD18-Tsimple载体中并测序;错配碱基经定点突变修复后,目的基因亚克隆至pThioHis(A)载体,构建了阿昌族G6PD基因野生型和G487A突变型原核表达载体:pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A。用重组质粒转化E.coli Competent Cells DF213(G6PD defeciency),经IPTG诱导G6PD表达、10%SDS-PAGE电泳检测表达蛋白和紫外340nm定量测定G6PD活性的分析表明,pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A在DF213中成功表达,分子量约为59kDa。IPTG诱导0、3、6、9、和12h后,G6PD活性逐渐增高,G6PD基因WT表达的酶活性约是G487A的20-25倍。表达载体的构建以及G6PDcDNA在DF213中成功表达,为重组酶G6PDG487A的进一步研究奠定了基础。     

金鱼同工酶的发生遗传学研究——Ⅲ.金鱼同工酶基因座位的加倍与多倍性

以鲫鱼和金鱼为材料,用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、乳酸脱氢酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶体系作为基因标志,从检测同工酶的多重组合形式来研究基因的加倍与演化。对彩鲫与金鱼G6PD和LDH同工酶的分析结果表明,它们均具有与四倍体鱼类相应的谱带。因而说明了金鱼的G6PD和LDH同工酶基因座位的加倍与染色体的多倍性有关,为金鱼是四倍体的假说提供了证据。而对MDH同工酶的分析却得到了与二倍体鱼类相同的谱带数。这可能与加倍基因发生突变而不表达有关。     

中国人体细胞染色体高分辨G带模式图

本工作应用高分辨染色体技术,分析了31名健康汉族人外周血的高分辨G带,制作了中国人体细胞染色体的高分辨G带核型图。并经镜下比较和照片剪贴配对分析,认为中国人体细胞高分辨G带的带纹顺序与宽窄基本与人类细胞遗传学高分辨显带命名的国际体制(ISCN,1981)中高分辨G带模式图一致,但在850条带阶段,1、2、8和Y染色体的某些区带与ISCN(1981)的模式图有些差别,故重新描绘了这四个染色体的模式图。     

实验细胞资源同功酶分析鉴定

琼脂糖凝胶电泳检测细胞同功酶的方法,可用于实验细胞系种间鉴别和交叉污染检测。该方法所需样品少,时间短,费用低,并且具有较高的灵敏度。本文对HeLa细胞进行了LD、MD、G6PD同功酶检测灵敏度分析,结果表明:HeLa细胞LD和MD同功酶在细胞为5×107个/L时可有效检测出来,而G6PD分析时细胞为109个/L。20种实验细胞的LD、MD同功酶检测证明,每种细胞种属来源清楚,且均未被其它细胞污染。     

人淋巴细胞和仓鼠成纤维细胞（Wg3h）十五种同工酶的分析方法

体细胞的融合技术,正被广泛应用于人类染色体的基因定位,杂交瘤细胞的形成和细胞恶变研究以及基因表达调控和进化的研究。对于杂种细胞的鉴定,分析其中的染色体组成,可以通过细胞遗传学水平的核型分析和对染色体基因标记酶的测定     

三倍体草鲂杂种及其双亲的细胞遗传学研究

用空气干燥法制片,Giemsa染色,检查草鱼、三角鲂及其杂交一代(简称草鲂杂种)的肾细胞染色体。双亲的二倍染色体均为48,草鲂杂种的染色体数目为72。草鱼染色体组型:20M+20SM+8ST;三角鲂染色体组型:18M+22SM+8ST,其亚中部着丝点染色体中有一对大型特征性标志染色体。根据比较双亲和草鲂杂种染色体组型特征,证实草鲂杂种是三倍体,组型为29M+31SM+12ST。其中草鱼提供了两份染色体,三角鲂提供了一份染色体。推测草鲂杂种染色体加倍原因是受精过程中卵子核内有丝分裂或第二极体的保留。