Vero细胞狂犬病疫苗在凝胶柱层析工艺中样品浓度对纯化效果的影响

为研究浓缩Vero细胞狂犬病疫苗蛋白浓度对纯化效果的影响。用超滤浓缩法对狂犬病疫苗进行不同倍数的超滤浓缩,将浓缩后不同倍数的样品分别用凝胶柱层析法进行纯化,结果样品浓度在40mg/ml以下时,狂犬病毒收集液中杂蛋白去除率可达99%以上,小牛血清含量在25-37.5ng/ml之间;浓缩超过40mg/ml时,并随着样品浓度的增加,狂犬病毒收集液中杂蛋白去除率逐渐下降,且有病毒丢失,因此采用凝胶柱层析法纯化狂犬病疫苗,蛋白浓度应低于40mg/ml。     

成纤维细胞对体外培养的骨胳肌细胞早期发育的影响

用无血清、无胚胎提取液的培养液培养由鸡胚腿肌制成的细胞悬液,在排除神经因素的条件下,研究成纤维细胞对体外培养的骨胳肌细胞早期发育的影响。实验组的培养液由2份培养过成纤维细胞的 Eagle's(MEM)液(条件培养液)和1份 Eagle's 液组成。对照组的培养液为 Eagle's 液。细胞悬液被稀释成7种密度(1×10~6—1×10~4细胞/ml)。所得结果如下;(1)成纤维细胞作为支架,肌母细胞在其上面分裂和融合。成纤维细胞的条件培养液维持肌细胞的存活,并促进其发育;(2)肌母细胞的融合与细胞密度有关。实验组肌母细胞融合所需的最低细胞密度是3×10~4细胞/ml,即30个细胞/mm~2,而对照组为3×10~5细胞/ml,即300个细胞/mm~2。实验结果提示,肌细胞早期发育可不依赖于神经因素,它能被胚眙肌肉中的成纤维细胞所促进。     

口蹄疫病毒非结构蛋白定量检测ELISA方法的建立

目的：利用口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体建立液相阻断ELISA检测方法,进行定量检测口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白含量。方法：首先将工作浓度的3B单抗与待测病毒培养液过夜结合反应,然后取结合液转移至用3B蛋白包被好的酶标板上,用标准3B蛋白做12个梯度做对照,同时设阴性对照和空白对照。通过回归分析算出口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白3B含量。结果： 回归曲线呈典型的S形,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R =0.99,检测范围为5~1500ng/ml,半数抑制浓度(Ic50)为130ng/ml。结论：该方法能特异、敏感的检测到病毒培养液中的非结构蛋白3B成分,并进行定量。     

铝对原代培养大鼠海马神经细胞毒性作用的初步观察

新生一天的大鼠海马神经细胞在含10％胎牛血清和10％小牛血清的DMEM培养液,5％CO_2,37℃的环境中可以获得良好的生长。用从微摩尔浓度至毫摩尔浓度的铝处理细胞1小时,细胞死亡率明显增加,并呈剂量依赖性。但10~(-3)mol/L浓度的铝却使死亡率突然降低,与10~(-4)mol/L比较具有极显著的统计学意义。铝的神经毒作用与细胞外液中钙离子存在与否无关,不能用传统的兴奋性学说来解释。     

商陆种子抗病毒蛋白的制备及毒性分析

采用一种改进的方法,从商陆属两种植物——商陆(Phytolacca acinosa)和美州商陆(P. americana)种子中分别制备抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein from seeds,简称PAP-s)。研究证明,两种植物中的PAP-s性质完全相同。经SDS-PAGE和凝胶过滤层析测得该蛋白质为单一肽链,分子量约30kD;聚丙烯酰胺等电聚焦电泳测得等电点为8.4;经Edman降解,测得N-末端氨基酸为Ile.PAP-s在兔网织红细胞裂解液中抑制蛋白质合成ID_(50)为2.6ng/ml(8.6×10~(-11)mol/1);将该蛋白质与脊髓灰质炎(?)型病毒混合接种于猴肾细胞培养液,显示出较强的抗病毒活性,浓度为4.17×10~(-8)mol/1时能抑制98％的病毒增殖。将PAP-s通过异型双功能连接剂SPDP与抗人T细胞单克隆抗体Wu71偶联制备免疫毒素,对T淋巴细胞白血病CEM细胞显示特异杀伤作用,在10~(-9)mol/1时可杀灭76.4％的靶细胞,~(14)C-亮氨酸掺入蛋白质合成抑制试验显示ID_(50)为10~(-10)—10~(-9)mol/l。     

六味地黄丸水提液对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的:研究六味地黄丸水提液体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。方法:以体外培养的人牙周膜成纤维细胞为实验基础,六味地黄丸水提液分组:药物浓度为0.001、0.01、0.1、1、10mg/ml,对照组药物浓度为0mg/ml,分别作用1、2、3、4、5天。用MTT法检测六味地黄丸水提液对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。结果:六味地黄丸水提液在浓度0.001-0.1mg/ml范围内对人牙周膜细胞增殖有促进作用,而1、10mg/ml时对细胞增殖表现抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:六味地黄丸水提液在一定药物浓度范围内能够促进体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖。     

大肠杆菌表达的人IL-6复性条件研究

采用稀释法复性,筛选重组人白细胞介素-6(rhIL-6)包涵体蛋白的复性条件。结果显示,复性液的浓度、pH值、复性时间和复性蛋白浓度,对重组人白细胞介素-6复性效果有很大影响。在复性液为2mol/L尿素、pH8.5、复性时间为24h和复性蛋白浓度50μg/ml条件下,重组人白细胞介素-6包涵体蛋白的复性效果最佳。     

超滤过结合密度梯度离心纯化鲍曼不动杆菌噬菌体方法的建立

目的 探讨获得低浓度内毒素和高滴度鲍曼不动杆菌噬菌体的方法,为制备安全的噬菌体生物制剂提供参考.方法 用可截留100 kD以上分子量的超滤离心管浓缩噬菌体裂解液并滤出分子量约为10 kD的内毒素,然后用蔗糖密度梯度离心纯化噬菌体浓缩液;分别测定超滤前、超滤后和纯化后的噬菌体滴度,采用鲎试验测定超滤前后内毒素的浓度,通过SDS-PAGE分析超滤前后和纯化后噬菌体蛋白的纯度.结果 经超滤离心法噬菌体滴度从3.9×1010 PFU/mL提高至1.68×1012PFU/mL,并可去除99.2％的内毒素;超滤过结合密度梯度离心后的SDS-PAGE可清晰呈现7种蛋白,分子量为29～100 kD.结论 超滤过结合密度梯度离心是一种简便、快速浓缩和纯化噬菌体的方法,并可有效地去除裂解液中的内毒素.     

黄瓜细菌性白枯病菌特异性抗体制备及其ELISA检测方法的建立

目的:制备黄瓜细菌性白枯病菌特异性抗体,建立其酶联免疫吸附分析(ELISA)的检测方法.方法:分别以黄瓜细菌性白枯病菌胞内蛋白和菌体为免疫原,制备两再种抗体,优化间接ELISA检测条件.结果:间接ELISA法测定两种纯化的菌体抗体(J4)和胞内蛋白抗体(P2)效价分别为1:32000和1:4000,二抗的最佳稀释度为1:3000,方阵试验表明J4的工作浓度为1:16000,抗原的最佳包被浓度为10<'6>cfu/ml,P2的工作浓度为1:2000,抗原的最佳包被浓度为10<'7>cfu/ml,两种抗体的灵敏度均为10<'5>cfu/ml,与黄瓜细菌性角斑病菌等26个菌株无交叉反应,特异性强.结论:成功制备了黄瓜细菌性白枯病菌特异性抗体,建立了ELISA检测方法.     

用固定化黑曲霉完整细胞连续生产柠檬酸

本研究比较了两种固定化黑曲霉完整细胞的方法:黑曲霉KCU520在30℃培养5天,用无菌水制成分生孢子悬液(10~7—10~8孢子/ml)。①在400ml80％海藻酸钠溶液中加入孢子悬液600ml,然后逐滴加到1％CaCl_2溶液中,形成的颗粒在10℃固定1小时备用。②聚丙烯酰胺凝胶(PAG)固定化,在64ml孢子悬液(4℃)中加丙烯酰胺12克,双丙烯酰胺     

ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

[目的]使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP) ELP[Ⅰ]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[Ⅰ]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响.[方法]人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[Ⅰ]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达.融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值.[结果]成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[Ⅰ]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时,Tt为28.6℃;而当PEG的浓度为5％、10％、15％、20％时,Tt分别降至22.3℃、15.9℃、6℃、0℃.[结论]ELP[Ⅰ]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白.     

食品上的应用

891702 用一种重组欧文氏菌使萄葡糖转化为2一酮一L一古洛糖酸-L一抗坏血酸合成中的中间产物[英〕/Grindley,J.F.…了Ap-pl.Environ.孔lierobio}一2985,54(7)一1770~1775仁译自DBA,一958,7(20),as一09861〕     

农业其它

940798由串珠镶抱产生的赤翔酸的分离仁英〕/Rachev,R.C.…厂J .Nat.Prod一工993,56(7)一1165~1170〔译自DBA,1993,12(19),93-11082〕 在已介绍条件下,将串珠镶抱培养万在100升发酵罐中。为了分离赤霉酸一3(GA3),用18% (wt./vol.)HCI将发酵液(50升)滤’液酸化到pH2.。~2.5井用5     

昆虫病毒重组质粒的快速提取

质粒的提取与纯化是基因工程的重要内容。我们用昆虫杆状病毒BsNPV DNA的Bam HI片段与质粒pBR322重组得到重组体pBSa18和pBSb36。用LB摇床培养。 质粒pBR322 DNA用Gonzalls等(1980)的常规法提取。重组质粒的提取是离心40ml培养液收获细胞,加pH7.8 4×TEA缓冲液50ml,GSE(甘油50％,SDS 5％,EDTA0.1M)18ml,70℃保温10分钟,-20℃冷冻过夜,次日在4℃离心12 000r/min15分钟,取上清直接进行制备性琼脂糖凝胶电     

用三步法纯化重组人促红细胞生成素

在生物反应器中培养中国仓鼠卵巢细胞—促红细胞生成素(CHO-EPO)C2细胞株,培养上清液中重组人促红细胞生成素(rHuEPO)表达水平达2000～3000U/ml。培养上清经过三步纯化:第一步为反相柱色谱,可将样品浓缩约96.7％,其收集液经充分透析后进行第二步的DEAE-离子交换色谱,最后进行分子筛色谱,总回收率为30％以上,经纯化的rHuEPO比活性为1.5×10~8U/g蛋白,SDSPAGE一条带,扫描测试纯度达98％以上。     

三七总皂甙诱导MSCs分化为神经元样细胞时胞内钙离子浓度变化的研究

目的探讨三七总皂甙(tPNS)诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞过程中细胞内钙离子浓度[Ca2 ]i的变化.方法 L-DMEM冲洗SD大鼠股骨骨髓腔,培养大鼠MSCs.选用第5代MSCs进行诱导分化,用含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的L-DMEM培养液预诱导24h,加入含10μmol/L Fluo-3/AM的L-DMEM培养液负载30min,最后更换成含三七总皂甙0.25g/L的无血清培养液,同时在波长为488nm激光下扫描观测细胞形态和荧光强度的变化.结果更换三七总皂甙诱导液后,细胞内荧光强度逐渐增加,到100s达高峰值,其后逐渐减弱,但20min时细胞荧光强度仍高于诱导前,此时可见MSCs开始向神经元样细胞分化.结论三七总皂甙在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞过程中胞内游离钙离子[Ca2 ]i浓度升高.     

重组人E1A激活基因阻遏子/myc-His融合糖蛋白的纯化及功能鉴定

目的:纯化重组人E1A激活基因阻遏子(hCREG)糖蛋白,验证重组hCREG糖蛋白具有抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖的生物学功能。方法:根据6×His亲和层析原理,应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白,纯化后蛋白通过HiTrap脱盐柱脱盐。用流式细胞周期分析研究添加0.5μg/ml、1μg/ml及2μg/ml重组hCREG/myc-His融合糖蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。用BrdU掺入方法研究重组蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。结果:根据6×His亲和层析原理用Ni-NTA纯化重组hCREG蛋白,浓缩并脱盐后的重组hCREG蛋白浓度为1.6mg/ml,纯度为92%,此蛋白仍保留了糖基化形式。流式细胞仪细胞周期分析结果提示重组hCREG蛋白可抑制体外培养的HITASY细胞增殖,且低浓度组的抑制效应要高于高浓度组。BrdU掺入实验结果提示,添加2μg/ml重组hCREG蛋白组与对照组相比可显著抑制体外培养的HITASY细胞增殖,组间比较有统计学差异(P0.05)。结论:具有生物学功能的重组hCREG/myc-His糖蛋白的成功纯化,为hCREG蛋白的功能研究及生物工程制备提供了实验平台。     

聚乙二醇对ELP[I]40相变温度的影响

目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响.方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt.结果:在ELP[I]40终浓度为25 μmol/L时,PEG浓度为5％,10％,15％,20％,25％时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃.结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化.     

动物细胞培养及单克隆抗体

.,J一,J沪.J”‘舌尹.刁7.’试J、~宁.护理J.合忠‘J产奋「下,924392用杆状病毒表达载体生产分离的异型户半乳箱普酶多肚仁英〕/Lieari,P.…/Biotechnol.B ioeng一1092,39(9)一932~944〔译自DBA,1992,11(11),92一06397〕 在草地夜蛾连续细胞系IPL一Sfg中表达首藉银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV),生产分离的异型户半乳糖普酶蛋白。在pol了hedrin启动子调控下,重组AeMNPV编码 polyhedrin一BG的融合蛋白。该启动子由转移载体质粒pAo36。和设计的360-lac构建。病毒侵染细胞后培养96小时,培养物经BG免疫沉淀放射自显影显示,有几条比B…     

血红蛋白基因在产CBHⅡ毕赤酵母工程菌中的表达

目的:提高毕赤酵母工程菌P.pastoris-CBHⅡ液体发酵产纤维二糖水解酶(CBHⅡ)的能力。方法:分别构建了用于胞外及胞内表达透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA-vhb与pPICZαA(-s)-vhb。通过电转化将两种质粒转化巴氏毕赤酵母重组菌体P.pastoris-CBHⅡ菌株,经过筛选分别获得可正确表达具有生物活性的VHb蛋白的重组菌株P.pastoris-CBHⅡ-vhb(胞内表达VHb)及P.pastoris-CBHⅡ-vhb(-s)(胞外表达VHb)。结果:摇瓶发酵实验表明,血红蛋白在贫氧条件下可促进CBHⅡ的分泌表达,培养液上清的CMC酶活分别从出发菌株P.pastoris-CBHⅡ的1.81U/ml提高到2.04U/ml(胞内表达VHb)与1.93U/ml(胞外表达VHb)。VHb蛋白胞内表达菌株比胞外表达菌株效果更明显。